El ARN del VPH CISH permite la detección de una infección activa por el virus del papiloma humano. Dado que la hibridación in situ se dirige al ARN del VPH, esta técnica permite la visualización de una transcripción activa del virus. Tiene una resolución espacial precisa y un buen diagnóstico.
La detección del VPH puede apoyar el diagnóstico de varias lesiones relacionadas con el VPH, como el carcinoma de células escamosas orofaríngeas o la neoplasia cervical. También puede tener una influencia en el pronóstico. Después de preparar tampones y reactivos contramanchas, prepare un reactivo de recuperación de destino x en un vaso grande añadiendo 70 mililitros de reactivo de recuperación de objetivo 10x a 630 mililitros de agua destilada.
Coloque el vaso de precipitados en una placa calefactora con agitador magnético y cúbralo con papel de aluminio. Hierve su contenido a 100 grados centígrados durante 10 a 15 minutos asegurándose de no hervirlo durante más de 30 minutos. Para bloquear la actividad de la peroxidasa en diapositivas con secciones de tejido previamente desparafinadas y colocadas en el portaobjetos, agregue de cuatro a seis gotas, lo suficiente para cubrir la muestra, de peróxido de hidrógeno a cada diapositiva, e incubarlas durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Lave los portaobjetos dos veces durante dos minutos en agua destilada a temperatura ambiente. Para romper los límites del tejido de ARN en las secciones del tejido de ARN, primero retire la lámina de aluminio de la ebullición de una x TRR usando una garra, y deje de agitar. Sumerja el portaobjetos lentamente y con mucho cuidado.
Cubra el vaso de precipitados de nuevo con la lámina de aluminio e incubar durante 15 minutos. Utilice la garra para transferir inmediatamente el portaobjetos caliente a un baño de agua destilada y lavarlo durante dos minutos. Lave los portaobjetos y luego en etanol fresco 100% durante dos minutos, y déjelos secar a temperatura ambiente durante dos minutos.
A continuación, utilice una pluma de barrera hidrófoba para dibujar una barrera alrededor de cada muestra, y déjela secar durante al menos cinco minutos. Para la digestión de la proteasa, coloque los portaobjetos en la bandeja controlada por humedad y agregue aproximadamente cuatro gotas de Protease Plus por muestra. Cubra la bandeja con una tapa e insértela en el horno de hibridación durante 30 minutos a 40 grados centígrados.
Retire la bandeja del horno y retire el portaobjetos. Trabajar una diapositiva a la vez, eliminar rápidamente cualquier exceso de líquido, y colocar el portaobjetos en el portaobjetos sumergido en un plato de tinción lleno de agua destilada. Lave los portaobjetos dos veces durante dos minutos en agua destilada a temperatura ambiente con agitación constante.
Para iniciar la hibridación, toque y deslice las diapositivas para eliminar el exceso de líquido y vuelva a colocarlas en el portaobjetos. Retire la sonda de VPH precalentada del horno y agregue aproximadamente cuatro gotas para cubrir completamente cada sección. Cubra la bandeja con la tapa e insértela en el horno durante dos horas a 40 grados centígrados.
Después de completar la incubación, retire la bandeja del horno y retire el portaobjetos. Una diapositiva a la vez, retire rápidamente el exceso de líquido y coloque el portaobjetos sumergido en un plato de tinción lleno de un tampón de lavado x, lave los portaobjetos durante dos minutos a temperatura ambiente con agitación constante y repita con un tampón de lavado de una x. Toque y deslice para eliminar cualquier exceso de líquido de las diapositivas y vuelva a colocarlos en el portaobjetos.
Agregue aproximadamente cuatro gotas de temperatura ambiente AMP1 por sección para cubrir por completo cada sección. Cubra la bandeja con la tapa e insértela en el horno durante 30 minutos a 40 grados centígrados. Después de retirar la bandeja del horno, retire el portaobjetos.
Trabajar una diapositiva a la vez, eliminar rápidamente cualquier exceso de líquido, y colocar el portaobjetos en el portaobjetos sumergido en un plato de tinción lleno de un tampón de lavado x, lavar durante dos minutos a temperatura ambiente con agitación constante, y repetir con un tampón de lavado fresco x. Dispensar el mismo número de gotas de cada solución DAB-A y DAB-B en un tubo de tamaño adecuado para hacer aproximadamente 120 microlitros de sustrato DAB por sección y vórtice. Tome cada diapositiva, una a la vez, desde el portaobjetos, y toque y deslice para eliminar el exceso de líquido y vuelva a colocarla en el portaobjetos.
Pipeta aproximadamente 120 microlitros de mezcla DAB en cada sección del tejido, asegurándose de que las secciones estén cubiertas. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, y proceder con la contramancha. Coloque una gota de medio de montaje por listón de vidrio, y luego coloque los listones en los portaobjetos y déjelos secar al aire.
Después de unas horas, proceda con la evaluación utilizando un microscopio óptico como se describe en el manuscrito. Como se describe aquí en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, la presencia de tinción punctiforma marrón en el citoplasma o en los núcleos de las células tumorales definió un caso positivo. Los resultados se dividieron en dos puntuaciones, RNA CISH alta y baja puntuación como se observó con un objetivo 20x.
La tinción de la puntuación de ARN CISH se considera baja cuando se observa en menos del 50% de las células tumorales y cubre menos del 80% de la superficie celular. Por otro lado, la puntuación de ARN CISH es alta cuando se observa en más del 50% de las células cancerosas manchadas, o con la superficie de tinción superior al 80% en más del 30% de las células tumorales. Uno nunca debe dejar que las diapositivas se sequen para la hibridación.
No olvide precalentar la sonda. Para cada muestra, realice un control positivo y negativo para evaluar la calidad del ARN.
