La de las técnicas automatizadas de microscopía electrónica de sección serial. El paso de limitación de velocidad en la tubería que conduce a la generación de modelos tridimensionales biológicos de procesamiento de imágenes. Nuestro protocolo proporciona una guía paso a paso para producir una construcción más densa de volúmenes de imagen en tan solo unos días.
Combinado con un enfoque para mediciones cuantitativas utilizando modelos tridimensionales. Con esta técnica, la estructura 3D de los tejidos, aparte del cerebro, potencialmente se puede analizar para identificar las deficiencias estructurales típicas de ciertas enfermedades y mejorar la estrategia diagnóstica. La segmentación es un paso tedioso.
Tómese el tiempo para que sea lo más preciso posible para evitar la corrección de una segmentación incorrecta y tener que reiniciar todo el proceso. El diseño del software a veces no es muy fácil de usar. Por lo tanto, es importante ver el trabajo de inicio en la segmentación.
Abra la pila de imágenes arrastrando y soltando el archivo nativo desde el microscopio que contiene la pila o compre arrastrando y soltando la carpeta que contiene toda la pila de imágenes en la ventana de software Una vez que se abre la pila vaya a la imagen, propiedades, para asegurarse de que el tamaño de los voxels se ha leído de los metadatos. Transforme la imagen en 8 bits haciendo clic en la imagen, escriba y seleccione 8 bits. Si la pila original se adquiere como baldosas diferentes, aplique costuras dentro de TrakEM2.
Cree un nuevo proyecto TrakEM2 utilizando Nuevas funciones integradas TrakEM2, si es necesario. En el gooey de TrakEM2, haga clic con el botón derecho en cualquier cosa'debajo de la ventana de plantilla, y seleccione agregar nueva lista de área secundaria'Arrastrar y soltar cualquier cosa'en la carpeta, bajo objetos del proyecto'y uno cualquier cosa'would appear there. Arrastre y suelte, la lista de áreas'de la plantilla a la cosa'ubicado bajo objetos de proyecto'En la ventana gráfica de la pila de imágenes, seleccione el espacio Z' con el cursor.
La lista de áreas aparecerá con el número de identificación único. Seleccione la herramienta de pincel en la parte superior y utilice el ratón para segmentar una estructura rellenando su citosol sobre toda la pila Z. Exportar la masa segmentada, que se utilizará en Ilastik como semilla para el tallado.
Para ello, haga clic con el botón derecho en el objeto de lista de áreas de la lista de espacios Z o en la máscara del puerto de vista y seleccione export'area list'as labels T-I-F. Dependiendo de la resolución necesaria para reconstrucciones adicionales, reduzca el tamaño de píxel de la pila de imágenes mediante el muestreo descendente. Tenga en cuenta los requisitos de memoria del software que se utilizará para la segmentación y reconstrucción.
Ilastik maneja pilas de hasta quinientos píxeles en X-Y. Tenga en cuenta, el tamaño mínimo que los objetos todavía parecen reconocibles y por lo tanto se pueden segmentar. Usar image'adjust size'Para mejorar el contraste y ayudar a la segmentación, el filtro de máscara desenfocada se puede aplicar para hacer que las membranas sean más nítidas.
Utilice process'filters'unsharp mass'Export the image stack as single images' para su posterior procesamiento en el software de segmentación, utilizando file'save as'image sequence' y elija TIFF'format. En la gooey principal de Ilastik, seleccione el módulo de tallado. Cargue la pila de imágenes, utilizando add new'y agregue un único volumen 3D/4D de la secuencia'Seleccionar directorio completo'y elija la carpeta que contiene la pila de imágenes guardada como archivos individuales'En la parte inferior de la nueva ventana, donde las opciones para cargar las imágenes están presentes, asegúrese de mantener Z"seleccionado.
Para los siguientes pasos, todas las operaciones y botones se pueden encontrar en el lado izquierdo del software principal gooey. En la ficha de preprocesamiento, utilice las opciones estándar ya activadas. Utilice los filtros ricos de líneas brillantes y mantenga la escala de filtro en 1.600.
Este perímetro puede modificarse después. Una vez finalizado el preprocesamiento, seleccione la página siguiente en el menú desplegable del módulo de etiquetado. Un objeto y un fondo están presentes de forma predeterminada.
Seleccione la semilla del objeto haciendo clic en ella y dibuje una línea encima de la estructura de interés. A continuación, seleccione la inicialización de fondo y dibuje una o varias líneas fuera del objeto que se va a reconstruir. Ahora, haga clic en segment'y espere.
Dependiendo de la potencia del equipo y del tamaño de la pila, la segmentación podría tardar de unos segundos a horas. Una vez hecho esto, una máscara semitransparente que resalta la segmentación debe aparecer en la parte superior de la estructura segmentada. Desplácese por la pila para comprobar la segmentación.
La segmentación, podría no ser precisa si no sigue la estructura de interés o se derrama de ella. Corrija cualquier derrame colocando una semilla de fondo en la segmentación derramada. Y agregue una semilla de objeto sobre el segmento no reconstruido del objeto de interés.
La corrección visual precisa de la segmentación con Ilastik puede ser tediosa, pero es esencial asegurarse de que los objetos exportados no contienen artefactos. Si la segmentación sigue sin ser correcta, intente modificar con el parámetro bias'que aumentará o disminuirá la cantidad de píxeles clasificados inciertos aceptados. Su valor es 0.95 de forma predeterminada.
Disminuya para limitar cualquier derrame o aumentar si la segmentación es demasiado conservadora. Otra posibilidad es hacer clic en el preprocesamiento y modificar el tamaño del filtro. Aumentar el valor minimizará los efectos similares al ruido de la sal y la pimienta, pero también hará que las membranas sean más borrosas y los detalles más pequeños más difíciles de detectar.
Esto podría limitar el derrame. Reitere todo lo que sea necesario siempre y cuando todos los objetos deseados se hayan segmentado. Una vez que un objeto haya terminado, navegue hasta segment'y haga clic en guardar el objeto actual'Dos nuevas semillas aparecerán para iniciar la segmentación de un nuevo objeto.
La superficie abstracta mide de inmediato como archivos O-B-J haciendo clic en exportar todas las mallas'Para visualizar los modelos segmentados manualmente en 3D dentro de TrakEM2, haga clic con el botón derecho en la lista de áreas, luego seleccione mostrar en 3D'A valor más alto generará una malla de menor resolución. Por último, exporte la malla 3D como WaveFront O-B-J' eligiendo en el archivo de menú'exportar superficies'WaveFront'Después de instalar el kit de herramientas neuro morph como se describe en el protocolo de texto, abra la licuadora. Importe los objetos mediante la importación por lotes de neuro morph haciendo clic en importar objetos en el menú de escena para importar varios objetos a la vez.
Asegúrese de activar, utilice re-mesh y sombreado suave. Seleccione el objeto de interés en el forro exterior y modifique la profundidad de ocárbol de la función de re-malla en el menú del modificador. Trabaje de forma iterativa para minimizar el número de vértices y evitar perder detalles en resolución y morfología correcta.
Al cambiar la profundidad de Octree, la malla en el gooey principal cambiará en consecuencia. Una vez terminado, haga clic en aplicar para finalizar el proceso. Navegue hasta el menú neuro morph en el panel izquierdo y utilice las interacciones de pila de imágenes de la herramienta de superposición de imágenes para cargar la pila de imágenes.
Asegúrese de introducir el tamaño físico de la pila de imágenes para X, Y y Z y seleccione la ruta de la pila haciendo clic en la fuente Z.X e Y son planos ortogonales. Son opcionales y se cargarán solo si el usuario inserta la ruta de acceso válida. A continuación, seleccione una malla en el puerto de vista haciendo clic con el botón derecho en ella.
Entre en el modo de edición presionando la pestaña, seleccione uno o más vértices con el botón derecho del ratón y, finalmente, haga clic en mostrar la imagen en el vértice. Uno o más planos cortados con el micrográfico aparecerán superpuestos en la parte superior de la malla. Seleccione el plano de corte haciendo clic con el botón derecho en él.
A continuación, presione el control Y y desplácese sobre el modelo 3D con el desplazamiento del ratón. Esto también se puede utilizar como método de corrección. Aquí se muestra la segmentación y reconstrucción utilizando TrakEM2 e Ilastik.
El gooey TrakEM2 se muestra con objetos segmentados manualmente en rojo. La máscara exportada se puede utilizar como entrada para la segmentación semiautomática. Desde Ilastik, las máscaras se pueden exportar a TrakEM2 para su corrección manual.
Las máscaras se pueden exportar como mallas triangulares 3D para revelar estructuras reconstruidas. En este ejemplo, cuatro neuronas, astrocitos, microglia y pericitos fueron reconstruidos usando este proceso. Se muestra un análisis 3D de morfologías reconstruidas utilizando herramientas personalizadas.
Aquí hay un volumen de imagen isotrópico de un conjunto de datos de microscopía electrónica de barrido de haz iónico enfocado. Una reconstrucción densa de estos datos revela axones, el proceso astrocítico y dendritas. Esta micrografía muestra ejemplos de objetivos para cuantificaciones como sinapsis y gránulos de glucógeno astrocítico.
La máscara de ese micrografo muestra la distribución de gránulos de glucógeno alrededor de las sinapsis. Aquí se muestra una ilustración gráfica de la entrada y salida de la visualización gráfica del modelo de absorción de lactato derivado del glucógeno o GLAM'Here, un usuario se muestra usando una realidad virtual o auriculares V-R mientras trabaja en la reconstrucción densa a partir de un conjunto de datos de microscopía electrónica de barrido de haz iónico enfocado. A partir de un subconjunto de neuritas, se puede observar una escena V-R inmersiva.
El láser verde apunta a un GLAM'peak. es de importancia primaria, ya que determina el tamaño correcto de los objetos 3D exportados y determina que sus mediciones reflejan su tamaño real. El concepto de imágenes de sección serie, segmentación de imágenes y construcción 3D es bastante antiguo.
Descubrir la aceleración técnica está llevando a avances en colectomies en la revisión de los libros de texto de anatomía. Aunque el método fue desarrollado para la investigación cerebral en microscopía electrónica, se puede generalizar a cualquier y la técnica de microscopía generando datos Además, cualquier tipo de técnica de imagen 3D puede beneficiarse de tales técnicas de segmentación y construcción de imágenes. Incluyendo escaneos C-T y M-R-I.
