The authors have nothing to disclose.

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las políticas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH) aprobadas por el Comité de Ética de Irán Universidad de Ciencias Médicas (Teherán, Irán). 1. Los animales, la cirugía y de muestras Preparaciones NOTA: Prepare el tejido cerebral para el análisis microscópico confocal 3D. <ol><li> Divida a los animales al azar en dos grupos: Aß 1-40: inyección (n = 8), y Aß 1-40: inyección con el tratamiento genisteína (n = 8); administrar la genisteína (10 mg / kg diluido en un vehículo tal como aceite de ricino polietoxilado) por sonda 1 hr antes de la cirugía. </li><li> Anestesiar a los animales con ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Confirme la anestesia adecuada por falta de reflejo de retirada después de pellizcar el dedo del pie. Use ungüento en los ojos durante la cirugía para prevenir la sequedad. </li><li> Colocar los animales en un aparato estereotáxico y la cabeza afeitada. Aplicar iodine solución para limpiar el cuero cabelludo antes de la incisión y mantener el lugar de la operación estéril durante la cirugía para reducir el riesgo de infección. Inyectar Aß 1-40 estereotáxicamente (4 l) en el hipocampo en -3,5 mm posterior al bregma, ± 2 mm lateral a la línea media, y -2.8 mm por debajo de la duramadre, de acuerdo con la rata cerebro atlas 8. Para el método estereotáxico consulte publicación anterior 9. </li><li> Proporcionar postoperatorio observación / cuidado hasta que los animales son totalmente consciente para garantizar la comodidad de los animales. Mantenga los animales cálido durante la recuperación, y no devolverlos a una jaula con otros animales hasta la recuperación completa. Preste atención a cualquier signo de infección en los animales después de la cirugía. </li><li> Anestesiar a los animales profundamente por ketamina (150 mg / kg) tres semanas después de la cirugía. Realizar la fijación por perfusión transcardial los animales con 0,9% de solución salina, seguido de paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 M (pH = 7,4), a continuación, quitar y fijar cerebro como se describe en 10 &lt;/ sup&gt;. </li><li> Post-fijar los cerebros en paraformaldehído al 4% durante 2-3 días a 4 ° C. </li><li> Incrustar el tejido en bloques de parafina mediante el uso de equipos de incrustación de tejidos, y evitar menores de llenado o sobre-llenar el casete ya que puede interferir con la alineación correcta o seccionamiento. Preste atención a la orientación del tejido en el bloque de parafina. NOTA: El hipocampo de rata, por ejemplo, se encuentra cerca de la parte posterior del hemisferio cerebral. Por lo tanto, el tejido debe ser empotrado en una forma que de seccionamiento comienza en parte posterior del cerebro. Utilice el atlas de Paxinos 8 como una guía para llegar a la estructura anatómica deseada. </li><li> Coloque el microtomo lejos de corrientes de aire o entradas de aire ya los movimientos del aire hacen que el manejo de las secciones difíciles. </li><li> Utilice secciones con un espesor micras ≥20 como con ser necesaria esta profundidad para producir imágenes Z-Stack de astrocitos completos. No utilice los primeros tramos de la pareja, ya que pueden tener un espesor no deseado debido a la térmica de correoXpansion. </li><li> Coloque las secciones en la superficie del agua caliente (5 ± 2 ° C, por debajo de la temperatura de fusión de la parafina) el tiempo suficiente para aplanar las secciones. NOTA: Durante la expansión de la sección puede perturbar la morfología de la estructura. Utilice pequeña brocha para transferir cuidadosamente secciones. Suma dos o tres secciones en cada diapositiva. </li><li> Diapositivas de las tiendas en un estante en una posición vertical y déjelos secar a 37 ° C durante varias horas o O / N. </li></ol> 2. La inmunohistoquímica <ol><li> Desparafinar secciones en xileno, 2 x 10 min, y se rehidratan a través de gradiente de alcohol (99,8%, 95%, y el 70%, 10 min cada uno) y PBS. </li><li> Incubar con anticuerpos contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) diluido 1: 1500 en PBS que contenía 0,25% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,25% de Triton X-100 y 3,5% de suero normal (O / N a 4 C). </li><li> Lávese las secciones en PBS durante 3 x 5 min. </li><li> Incubar con antibodie conjugado con fosfatasa alcalina secundarias durante 1 hora (1: 100, 21 ° C, se diluyó en PBS). </li><li> Lávese las secciones en PBS durante 3 x 5 min. NOTA: Es importante lavarse las secciones correctamente después de anticuerpos secundarios para reducir al mínimo la tinción de fondo. </li><li> Incubar las secciones en la oscuridad con líquido Permanente Red cromógeno (15-20 min). Nota: Preparar la solución de no más de 30 min antes de su uso. </li><li> Lávese las secciones en PBS durante 3 x 5 min. </li><li> Finalmente, teñir los núcleos con 4-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1: 500, diluido en PBS) antes de cubrir-deslizamiento. Guarde las diapositivas en el refrigerador 24 a 48 horas antes de la microscopía. </li></ol> 3. Microscopía Confocal NOTA: Para la evaluación cuantitativa (ver más abajo), seleccione un astrocito con un núcleo DAPI-manchado claramente visible con un mínimo de superposición de ramas para reducir el riesgo de errores. Producir imágenes Z-Stack es mucho tiempo. Sea paciente y no se detenga durante el procesamiento. Confocal láser vertical microscopio de barrido es de used para crear imágenes en 3D a partir de astrocitos. <ol><li> Poner la diapositiva en la platina del microscopio, y seleccione el objetivo 63X. </li><li> Abra el software de imagen y haga clic en sistema Start. Haga clic en la ficha Localizar. Ir a Asignar y seleccione las buenas prácticas agrarias para ajustar la luz adecuada. </li><li> Abra el obturador para reflejar la luz. Encuentra el revólver reflector en el lado derecho de obturación y elegir el color que debe ser reflejada por los astrocitos (verde, rojo o violeta); de color rojo (FSet20 wf) se utiliza aquí. NOTA: No se olvide de enfocar la imagen directamente en el ocular del microscopio. </li><li> Para encontrar el mejor enfoque, haga clic en Todos cerrada, ponga el pasador microscopio en el modo de pantalla y haga clic en la ficha Adquisición. </li><li> Haga clic en Configuración de Smart en la ficha Adquisición; se abre una ventana. Seleccione el fluoróforo adecuado (es decir DAPI y Alexa Fluor 555, en el proyecto actual) de la lista. El color se selecciona automáticamente. </li><li> Haga click en la mejor señal y Aplicar, luego haga clic en Ajuste de exposición; el ordenador se ajusta automáticamente los parámetros de exposición. </li><li> Para la optimización de la imagen, vaya a la ventana de Canales. Desmarcar Track2, resalte Track1 y haga clic en Live. Enfoque la imagen si es necesario. </li><li> En la ventana de Canales ajustar las siguientes teclas; haga clic en 1AU optimizar automáticamente el agujero. Es muy importante hacer este paso de lo contrario las imágenes confocal serán no óptima. Ajuste de ganancia para tener la mejor intensidad (mantener esta configuración por debajo de 800 para reducir el ruido extra). Por último, establezca la ganancia digital entre 2 y 3. </li><li> Desmarcar Track1, haga clic en Track2 y repita el paso 3.8 para Track2. Entonces deja de Live. </li><li> Vaya a la ventana Modo de adquisición. Mejorar la imagen mediante la optimización del tamaño constructivo y de promedio. Con el fin de cambiar el tamaño de fotograma ir a X * Y y seleccione 1024 x 1024. Elija una velocidad lenta para crear una mejor imagen. </li><li> Ir a promediado y seleccione un Número ≥4. Este valor promedio indica el número de exploraciones que se promedian para produccióne la imagen adquirida. Ahora haga clic en el botón Snap, y guardar la imagen en 2D capturado. </li><li> Para imágenes en 3D, marque el elemento Z-Stack bajo Smart Setup causando la ventana Z-Stack para abrir. </li><li> Establecer las primeras y últimas posiciones para la Z-Stack, es decir, la profundidad de la célula. En primer lugar, haga clic en Live. A continuación, utilice la unidad de enfoque del microscopio para centrarse en la posición más alta de los astrocitos en el tejido, en el que el Z-Stack es empezar. Haga clic en Configurar Primera. Entonces centrarse abajo a la posición más baja de la astrocitos en el tejido, en donde se debe detener la exploración Z-Stack. Haga clic en Configurar Última. Entonces deja de Live. </li><li> Elija el intervalo; 1,01 micras se usa en el presente estudio; intervalo de la elección se puede hacer haciendo clic en Óptima para establecer el número de rebanadas. </li><li> Haga clic en Inicio Experimento. Guardar las imágenes una vez finalizada la exploración. Esta imagen se utilizará para la medición de los siguientes parámetros: área de superficie y el volumen del territorio de astrocitos, todo el astrocito incluyendo sujetadorpinzones, cuerpo de la célula, y el núcleo. </li><li> Adquirir una imagen 2D usando un objetivo 10X o 20X, como se describe en los pasos 3.6-3.11. Esta imagen se puede utilizar para la medición de la intensidad de la fluorescencia inmunorreactividad de anticuerpos, y la densidad de astrocitos (número / 1000 m 2). </li></ol> 4. Densidad Astrocyte y GFAP + intensidad de fluorescencia <ol><li> Abra la imagen 20X 2D. Haga clic en Histo (Hisogram) en el lado izquierdo de la ventana de la imagen. </li><li> Para calcular la densidad de astrocitos, seleccione tres campos visuales consecutivos bajo el objetivo 20X. Cuente el número de astrocitos que muestran un soma clara con un mínimo, sucursales en los campos de la superposición. </li><li> Para cuantificar la intensidad de fluorescencia, seleccione una herramienta adecuada (rectángulo o círculo) en el pie de página de la ventana de imagen y elegir un área para la medición. Tenga en cuenta el valor medio y la desviación estándar aparecen automáticamente en la imagen. En el estudio actual, un área rectangular de 0,7 mm 2 entre strse utilizó iatum y la cuchilla medial del giro dentado. </li></ol> 5. Ramas astrocitos <ol><li> Para cuantificar la longitud y el número total de sucursales, utilizar imágenes 3D (adquiridos con 20X) en el software de análisis de imágenes. Dibuja una línea manualmente a lo largo de la longitud de cada rama del astrocito seleccionado. A continuación, seleccione la herramienta de medición que está especializada para la medición de la línea de longitud. Con el fin de cuantificar el número de sucursales, seleccione la cuenta-herramienta para contar el número de elementos marcados. </li></ol> 6. Volumen y Superficie NOTA: Marcar una estructura de forma manual en 3D software de análisis de imágenes requiere concentración y la formación. Practique varias veces antes de iniciar un experimento. <ol><li> Para cuantificar el volumen y el área de superficie del núcleo de astrocitos, soma, cuerpo de la célula y el territorio, transferir las imágenes 3D (adquiridas en los Pasos 3.1-3.16) a un software de análisis de imagen en 3D tales como Volocity 6.1. </li><li> Abra el software y crear una nuevabiblioteca. Arrastre todas las imágenes a la columna gris que queda en la nueva biblioteca. A continuación, seleccione una imagen en 3D. A la derecha, hay diferentes canales con diferentes colores. Encienda un canal de interés; por ejemplo, el canal azul para DAPI al medir el núcleo. Cambie el brillo de forma manual para obtener un contraste óptimo. </li><li> Seleccione el menú Herramientas, vaya a Hacer Volumen y producir una sola imagen en 3D de imágenes Z-stack. Haga clic en Propiedades en el menú Edición y asegúrese de que X, se presentan Y y Z propiedades; de lo contrario es imposible llevar a cabo el análisis 3D. </li><li> Haga clic en icono de la herramienta Freehand RIO en la barra de herramientas. Para medir el volumen y el área superficial del núcleo de astrocitos dibujar una línea alrededor del núcleo DAPI marcado. </li><li> Para medir el volumen y el área superficial del cuerpo celular de astrocitos dibujar una línea alrededor del soma excluyendo ramas. </li><li> Para medir el volumen y el área superficial de los astrocitos entero (cuerpo celular incluyendo sucursales) dibujar una línea alrededor del soma tras lasuperficie de todas las ramas. </li><li> Para evaluar el volumen y el área de superficie del territorio astrocito trazar una línea entre las puntas de las ramas. NOTA: Presione la tecla Supr en el teclado para borrar dibujos no deseados. </li><li> Haga clic en el menú de mediciones en la parte superior de la ventana de imagen para crear un protocolo de medición; se abre una ventana con diferentes herramientas. </li><li> Arrastre Encuentra objetos a la parte superior de la ventana (panel). Dé un nombre descriptivo para la Población 1, seleccione el color asociado, y haga clic en Medida. Se abrirá otra ventana. </li><li> Elija un área de parámetros, es decir, el volumen o superficie. Haga clic en Aceptar. Aparecerán los datos en una tabla. </li><li> Para guardar los datos, haga clic en el menú Medición y seleccione Crear artículo Medición. </li><li> Seleccione un nuevo elemento de medida llamada desde la ventana abierta. A continuación, dar un nombre a los datos y haga clic en Aceptar. </li><li> Por último, exportar los datos al software de estadísticas como Graph almohadilla o programa de superación. Utilice la prueba t para analizar los datos, y luego trazar 2D grHPA. </li></ol>

<ol>
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Este trabajo fue apoyado por becas de la Diputación Provincial de Östergötland, (Suecia) y el Celular y Molecular Research Center en Irán Universidad de Ciencias Médicas (Teherán, Irán).

En el protocolo actual, hemos empleado morfometría confocal 3D para evaluar 12 parámetros diferentes que se asociaron con la morfología de astrocitos. Para este fin, el tejido del hipocampo de ratas con Aß 1-40 - se utilizaron astrogliosis inducida, con o sin pretratamiento genisteína como un agente anti-inflamatorio. Mediante el uso de imágenes en 3D y software morfométricos, hemos sido capaces de mostrar el efecto de la genisteína en astrogliosis es decir, la morfología de los astrocitos. ...

En el sistema nervioso central saludable (CNS), los astrocitos desempeñan un papel importante en la regulación del flujo sanguíneo, el metabolismo energético, la función sináptica y la plasticidad, y el ion extracelular y neurotransmisor homeostasis a 1-3. Además, los astrocitos responden a diferentes estímulos nocivos y condiciones anormales, tales como trauma, infección, isquemia o la neurodegeneración a través de astrogliosis reactiva que se caracteriza por la hipertrofia, proliferación y remodelación funcional de astrocitos 4,5. Astrogliosis reactiva puede diseñar la respuesta inflamatoria y proceso de reparación en el tejido y, por lo tanto, puede afectar a la evolución clínica de las intervenciones terapéuticas. En consecuencia, los astrocitos han recibido atención por parte de neurólogo durante las últimas décadas como objetivos potenciales para las intervenciones terapéuticas para una variedad de enfermedades que afectan el sistema nervioso central. Los astrocitos tienen normalmente una forma estrellada con el bienestar dramas efined que se extienden alrededor del soma 6. En una condición de enfermedad en el cerebro, se convierten en las ramas de astrocitos enrevesada hinchados y muestran extremos 7, por ejemplo en la presencia de beta amiloide (Aß). En este artículo se presenta un protocolo para el análisis de imágenes en 3D de astrocitos adquiridos por microscopía confocal. Se midieron doce parámetros cuantitativos diferentes para cada astrocito: las áreas superficiales y volúmenes de astrocito el territorio (el tejido cubierto por un astrocito), célula entera (incluyendo ramas), cuerpo de la célula, y el núcleo; la longitud total y el número de sucursales; la intensidad de fluorescencia de los anticuerpos utilizados para la detección de astrocitos; y la densidad de los astrocitos (número / 1000 m 2). Para este fin, hemos utilizado las secciones del cerebro de ratas expuestas a intrahipocampal inyección de Aß 1-40 con o sin tratamiento genisteína como una sustancia anti-inflamatorio. El protocolo descrito se puede utilizar para una morfométricoÁLISIS de diferentes tipos de células in vitro o in vivo en diferentes condiciones.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Como las células gliales en el cerebro, los astrocitos tienen diversos papeles funcionales en el sistema nervioso central. En presencia de estímulos nocivos, los astrocitos modifican sus propiedades funcionales y estructurales, una condición llamada astrogliosis reactiva. Aquí, se presenta un protocolo para la evaluación de las propiedades morfológicas de los astrocitos. Este protocolo incluye la cuantificación de 12 parámetros diferentes es decir, la superficie y el volumen del tejido cubierto por un astrocito (territorio de astrocitos), todo el astrocito incluyendo sucursales, cuerpo celular y núcleo, así como la longitud total y el número de sucursales, la intensidad de la fluorescencia inmunorreactividad de los anticuerpos utilizados para la detección de astrocitos, y la densidad de astrocitos (número / 1000 m 2). Para ello se crearon tres dimensiones (3D) imágenes microscópicas confocal, y la imagen 3D software de análisis, como se utilizó Volocity 6.3 para mediciones. Tejido cerebral de rata expuestos a beta amiloide 1-40 </se utilizó sub&gt; (Aß 1-40) con o sin una intervención terapéutica para presentar el método. Este protocolo también se puede utilizar para el análisis morfométrico 3D de otras células a partir de ya sea in vivo o in vitro condiciones.

Esta sección presenta algunos ejemplos de las observaciones cualitativas y cuantitativas producidos por análisis morfométrico 3D. Para los resultados completos de los 12 parámetros mencionados anteriormente, por favor, consulte nuestra publicación anterior 10. Observaciones cualitativas Los astrocitos mostraron ramas delgadas o gruesas que eran por lo general mucho tiempo en Aß 1-40 ratas inyectadas (Figura 1). Se obse...

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K vistas.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

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Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Los análisis morfométricos de las Secciones de retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Investigación

Neurociencias

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Disección y Cultura de ratón dopaminérgico estriatal en explantes y tridimensionales ensayos matriz de colágeno

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

Protocolo papilas Denver para el Análisis Objetivo de papilas fungiformes

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Modelado de formas tridimensionales y análisis de estructuras cerebrales

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Preparación del tejido cerebral de rata recién nacida para el análisis Morfolométrico ultraestructural de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos