Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo del inmunometabolismo sobre la contribución de las células inmunitarias a la inflamación inducida por la obesidad en adiposo y esteatohepatitis en el tejido hepático. Estas técnicas se han optimizado para el aislamiento de células inmunitarias adiposas y hepáticas en un modelo inducido por la dieta de esteatohepatitis no alcohólica lograda a través de una carcasa de roedores libre de patógenos no específica. Estos métodos pueden ayudar a profundizar nuestra comprensión de los mecanismos inmunológicos involucrados en el mantenimiento de la homeostasis metabólica.
Generalmente, los individuos nuevos en esta técnica tendrán problemas para maximizar el rendimiento de las células disociadas funcionalmente viables y establecer el gating adecuado en la citometría de flujo. Para generar una suspensión de una sola célula de tejido adiposo, rocíe el pecho de un ratón eutanizado con 70%etanol, y cuidadosamente haga una incisión central de cinco a seis centímetros a través del integumento y la pared abdominal a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural y el corazón. Con una aguja de calibre 26, inyecte al menos 10 mililitros de solución salina al 0,9% en el ápice del ventrículo izquierdo y utilice tijeras para abrir la cavidad peritoneal.
Luego, disecciona el tejido adiposo epigonadal, y pesa. Disocia mecánicamente el tejido adiposo en trozos finos en una placa de Petri a cuatro grados Celsius antes de transferir los fragmentos de tejido a un tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el plato de Petri con un mililitro de albúmina sérica 0.5%bovina, o BSA, en PBS, y agregue tres mililitros de solución digestiva de tejido adiposo recién preparada por gramo de tejido adiposo al tubo.
Después de 20 minutos a 37 grados celsius y 200 rotaciones por minuto, agregue cinco mililitros de 0.5%BSA en PBS, y coloque el resumen adiposo en hielo. Triturar la solución varias veces con una pipeta serológica de 10 mililitros, y utilizar un émbolo para pasar la solución a través de un colador de 100 micrómetros. Separe las fracciones tisulares por centrifugación y use una pipeta para desechar la fracción de adipocitos flotantes.
Resuspender el gránulo de células de fracción vascular estromal en un mililitro de amonio-cloruro-potasio, o ACK, tampón de lelisis, deteniendo la reacción de la lysis con 10 mililitros de 2%suero de ternera fetal, o FCS, en PBS después de unos segundos. Luego, recoger los glóbulos blancos aislados por centrifugación, y resuspender el pellet en 250 microlitros de 2%FCS en PBS para el conteo. Cosecha el hígado en un tubo cónico de PBS sobre hielo antes de usar sellos de jeringa para disociar mecánicamente el tejido en una placa de Petri a cuatro grados centígrados.
Transfiera los fragmentos de tejido hepático diseccionados en un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de solución de digestión hepática caliente, y enjuague el plato Petri con tres mililitros de solución de digestión hepática fresca. Después de 20 minutos a 37 grados centígrados y 200 rotaciones por minuto, detenga la digestión con 20 mililitros de HBSS, y triturar la lodo tisular varias veces con una pipeta serológica de 10 mililitros. Utilice un émbolo para pasar la solución de tejido a través de un colador de 100 micrómetros y recoger las células hepáticas por centrifugación.
Resuspender el pellet en 20 mililitros de HBSS fresco, y eliminar la matriz de hepatocitos por centrifugación. Recoger el sobrenadante para centrifugación, resuspendiendo el pellet en 10 mililitros de 33% de baja densidad de densidad gradiente de solución media en HBSS. Separe las células inmunitarias hepáticas por centrifugación de gradiente de densidad, y resuspenda el pellet de leucocitos en un mililitro de tampón de lisis ACK.
Después de cuatro minutos a temperatura ambiente, detenga la lelisis con 10 mililitros de HBSS, y filtre las células a través de un colador de poro de 30 micrómetros en un tubo de 15 mililitros para la centrifugación. Luego, resuspender el pellet en 250 microlitros de 2%FCS en PBS para el conteo. Para el análisis citométrico de flujo de las poblaciones aisladas de leucocitos, sume hasta tres veces 10 a las seis células en 100 microlitros de 2%FCS en PBS desde el tejido de interés en la clasificación celular activada por fluorescencia de poliestireno individual, o FACS, tubos.
Añadir 10 microlitros de anticuerpos anti-CD16/CD32 a cada tubo para bloquear cualquier unión no específica durante 10 minutos en hielo, seguido de tinción con el volumen adecuado de mezcla de anticuerpos y un microlitro de tinte de viabilidad por muestra para permitir la discriminación de células vivas y muertas. Después de 20 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz, lave las muestras dos veces con dos mililitros de 2%FCS más PBS por lavado, y centrífuga a 300 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego, resuspender el pellet en PBS fresco más FCS.
Para analizar las células por citometría de flujo, utilice una muestra de control negativo no manchada para establecer la dispersión hacia adelante y hacia un lado, y ajuste las tensiones del citometro de flujo para detectar la población viable de leucocitos y para excluir los desechos. A continuación, ejecute muestras de control de manchas individuales para una compensación multicolor antes de ejecutar las muestras experimentales, recogiendo al menos cinco veces 10 a los cuatro eventos por tubo. A continuación, exporte los archivos de datos FCS para su análisis y establezca la estrategia de medición para los leucocitos CD45 positivos para permitir la identificación de las poblaciones de células inmunitarias subsiguientes de interés.
Aquí, se muestra una estrategia representativa de gating para subpoblaciones de células T que incluye discriminación por doblete y tinción de viabilidad en la grasa perigonadal murina. Los leucocitos CD45 positivos se cierran primero para CD4 y CD8 y, posteriormente, para que el ligando CD44 y CD62 discrimine entre células T ingenuas, memoria central, efectores y efectores. Las células CD44 positivas se caracterizan con CD127, receptor similar a la lectina de células asesinas G1 y muerte programada-1.
Aquí, se muestra la estrategia de gating para analizar células B, granulocitos, células asesinas naturales, macrófagos y células dendríticas. Un mayor porcentaje de memoria efectora CD4 positivo y células CD8 positivas se puede detectar en ratones de dieta alta en grasas alojados en condiciones no SPF, mientras que las células T intrahepáticas ingenuas CD4 positivas y CD8 positivas se encuentran considerablemente más bajas en estos animales en comparación con los ratones con dieta baja en grasas SPF en la semana siete. Esteatosis grave, incluyendo un aumento de grandes gotas de lípidos que resultan en esteatosis macrovesicular, inflamación lobular, globo hepatocelular, y la estructura lobular destruida se encuentra en ratones expuestos a dieta alta en grasa, mientras que sólo algunos ratones SPF muestran una leve acumulación de grasa en el hígado.
Además, el porcentaje de células asesinas naturales es mayor en el tejido adiposo perigonadal de ratones expuestos con dieta alta en grasas, mientras que los ratones SPF de dieta alta en grasas demostraron mayores porcentajes de células dendríticas. Al intentar este procedimiento, es importante mantener las células en hielo y en la oscuridad a menos que se indique lo contrario. Ahora debe tener una buena comprensión de cómo preparar correctamente las suspensiones de una sola célula y cómo aislar el tejido adiposo y hepático murino para los experimentos de citometría de flujo.
