NASH es una de las enfermedades hepáticas crónicas más importantes del mundo. Puede progresar a fibrosis, cirrosis y, finalmente, cáncer de hígado. Estudiar el cambio dinámico de la ECM en la EHNA puede ayudar a comprender mejor la fibrosis.
Las imágenes tradicionales no pueden demostrar cambios en la estructura de la ECM 3D, lo que limita la comprensión del proceso de remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática. Para comenzar, pese el ratón antes del procedimiento. Después de anestesiar al ratón, afeite el área ventral con un cortapelos y desinfecte la piel con etanol al 70%.
Coloque el ratón sobre su espalda e inmovilice las patas en la placa quirúrgica con cinta adhesiva. Use tijeras Mayo y fórceps Adson para hacer una incisión de tres centímetros lateralmente en la parte inferior del abdomen. Y luego una incisión de cinco centímetros verticalmente desde la parte baja del abdomen hasta el proceso xifoide sin abrir la cavidad torácica.
Después de abrir el peritoneo, coloque suavemente los intestinos a la izquierda del animal y eleve el lóbulo derecho del hígado con un aplicador con punta de rayón para exponer la vena porta. Para cateterizar la vena porta, inducir un catéter IV de calibre 24 en el extremo distal de la vena porta. Coloque la punta del catéter antes de que la vena porta se ramifique hacia los lóbulos hepáticos.
Extraiga la aguja inmediatamente cuando el catéter entre en la vena. Verifique que el catéter esté colocado correctamente dentro de la vena perfundiendo el hígado con PBS usando una jeringa de un mililitro a través del catéter. Use microfórceps Dumont, una microaguja Castroviejo y sutura 4-0 para colocar una sutura debajo de la ramificación de la vena porta y una segunda puntada un centímetro más abajo para asegurar el catéter.
Conecte el catéter a un tubo de silicona de un metro de longitud, tres milímetros de diámetro interior y 4,1 milímetros de diámetro exterior con un conector de señuelo. Conecte el tubo de silicona a una bomba peristáltica y a un depósito que contenga agua desionizada. Retire con cuidado las burbujas de aire dentro del tubo y evite generar nuevas burbujas durante la perfusión.
Ajuste la bomba peristáltica a una salida de flujo de 0,2 mililitros por minuto. Examine primero con agua desionizada durante dos horas y el color del hígado cambiará de rojo a amarillo durante la perfusión. Cambie la solución de perfusión a desoxicolato de sodio al 0,5% y continúe durante la noche y el hígado se volverá blanco al final de la perfusión.
Cambie la solución de perfusión a agua desionizada y perfunda durante dos horas. Use microfórceps Dumont y tijeras de resorte micros para recoger el hígado descelularizado y lavarlo cuidadosamente en una placa de Petri con PBS. Transfiera una pequeña pieza de hígado descelularizado a un portaobjetos de microscopio y coloque el tejido en el medio.
Agregue 10 microlitros de medio de montaje antidecoloración al tejido con una pipeta para evitar que el tejido se seque. Cubra el pañuelo con un vaso de cobertura y aplique una pequeña fuerza para aplanar la muestra. Selle los bordes del vidrio de la cubierta con esmalte de uñas incoloro y transparente.
Coloque una gota de aceite de inmersión en la parte superior del vidrio de la cubierta y coloque el portaobjetos en el portaobjetos del microscopio. Baje la lente del objetivo de aceite 20X hasta que entre en contacto con el aceite de inmersión. Cambie al canal violeta de longitud de onda 405 nanómetros.
Encienda el obturador y enfoque la muestra. Navegue y posicione el área de interés para la obtención de imágenes. Apague el obturador antes de pasar a la adquisición de imágenes mediante luz láser.
Para iniciar el láser de dos fotones, cambie al control de la computadora y encienda primero el láser de dos fotones. Luego encienda el controlador láser de dos fotones y el obturador asegurándose de que la potencia de salida sea superior a 2,5 vatios. Reduzca la potencia del láser para evitar el enfriamiento de la fluorescencia.
Seleccione y ajuste los detectores tanto de fotomultiplicadores como del híbrido para acomodar los fluoróforos elegidos. Elija adquisiciones de imágenes simultáneas o secuenciales. Ajuste el agujero de alfiler al valor más alto.
Ajuste las longitudes de onda del láser, la ganancia, la potencia, el desplazamiento del tiempo de permanencia de píxeles, el promedio de tamaño de píxel y el zoom. Desplácese por el controlador Z del ordenador y establezca las dimensiones Z. Defina los puntos inicial y final y elija el número de imágenes proporcionadas dentro de un volumen.
Adquirir imágenes. Después de realizar la microscopía de dos fotones, las fibras de colágeno sin descelularización revelaron una imagen de baja resolución de la red de colágeno. En la matriz extracelular descelularizada, se observaron diferencias aparentes en la morfología y distribución espacial entre los hígados de comida rápida y comida rápida.
Las fibras de colágeno y los ratones en una dieta de comida exhibieron una red entrelazada y bien organizada, mientras que los ratones en la dieta de comida rápida mostraron paquetes de colágeno con menos conectividad. La estructura tridimensional de la matriz extracelular del hígado muestra que las fibras de colágeno en ratones en la dieta chow mostraron una red bien organizada, pero no en ratones de dieta de comida rápida. Para confirmar la calidad del colágeno fibrilar en la matriz extracelular descelularizada, los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina eosina y rojo Picrosirius.
La hematoxilina y la eosina muestran que todas las células han sido eliminadas. En las imágenes de tinción roja de Picrosirius, la matriz extracelular de los ratones alimentados con chow reveló una red bien organizada. Y en contraste, los ratones con dieta de comida rápida mostraron fibras de colágeno más densas.
Retire con cuidado la burbuja dentro de un tubo antes de la perfusión. La burbuja bloqueará el vaso en el hígado y afectará la perfusión.
