Este sensor de tensión integrativa basado en el ADN, o ITS, convirtiendo la señal de fuerza a fluorescencia localmente permite la imagen directa de la fuerza celular con microscopía de fluorescencia. ITS tiene una alta resolución espacial y una alta sensibilidad. El umbral de activación es sintonizable, permitiendo una imagen selectiva de la tensión de integrina a diferentes niveles.
Después de recibir el ADN de una sola cadena personalizado, o ssDNA, de interés, para conjugar el péptido RGD al quencher de ssDNA tiolado, agregue primero 100 microlitros de 0.5-molar EDTA en 400 microlitros de agua a unos 450 microlitros de solución TCEP recién preparada. A continuación, añada 10 microlitros de la solución TCEP-EDTA a 20 microlitros de un quencher de ADN tiol mililitrolar en PBS para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Para conjugar la amina RGD con sulfo-SMCC, agregue 40 microlitros de sulfo-SMCC 23 mililo-SMCC recién preparados a 100 microlitros de solución de amina RGD de 11 milímetros recién preparada para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente.
Para conjugar RGD amine SMCC con el quencher ssDNA tiolado, mezcle todo el volumen de la solución de quencher ssDNA tiolada con todo el volumen de la solución SMCC de amina RGD para una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, transfiera la solución al almacenamiento de cuatro grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, mezcle el cloruro de sodio de tres molares con la solución de ADN conjugado con tiol y menos 20 grados Celsius, refrigerado, 100% etanol en una proporción de uno a 10 a 25, y coloque la reacción en menos 20 grados Celsius durante unos 30 minutos.
Cuando el ADN se ha precipitado, recoger el ADN por centrifugación, y resuspender el pellet en PBS para la medición de la concentración de ADN en un espectrómetro. Para el sensor de tensión integrativa, o ITS, síntesis, mezcle las soluciones de ADN de hebra superior e inferior en una relación de 1,1 a uno molar, e incubar la reacción durante la noche a cuatro grados centígrados antes de colocar alícuotas de la mezcla a menos 20 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo. Para la inmovilización DE ITS, cubra un plato Petri de 29 milímetros de diámetro, con fondo de vidrio con 200 microlitros de 0,1 miligramos por mililitro de albúmina sérica bovina biotinilada, o BSA-biotina, durante 30 minutos a cuatro grados Centígrados.
Cuando la BSA-biotina se haya adsorbido físicamente en la superficie de vidrio, lave el plato tres veces con 200 microlitros de PBS fresco por lavado, seguido de incubación con 200 microlitros de 50 microgramos por mililitro de proteína avidin durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lave el plato tres veces con PBS como se ha demostrado, y agregue 200 microlitros de 0,1 micromolares DE STI para otra incubación de 30 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lave el plato tres veces con PBS, dejando el último lavado en el plato hasta el revestimiento de la célula.
Para iniciar un cultivo de queratocito de pescado, utilice una pinza de punta plana para arrancar un pedazo de escama de un pez, y presione suavemente la báscula sobre el pozo de un plato Petri de fondo de vidrio sin modificar, con el lado interno de la báscula en contacto con el vaso. Espere unos 30 segundos para que la escama de pescado se adhiera a la superficie de vidrio del plato antes de cubrir la báscula con un milímetro de medio completo de Dulbecco modificado de Iscove. Luego, incubar la báscula en una caja oscura y húmeda durante seis a 48 horas a temperatura ambiente.
Para placar los queratocitos sobre la superficie ITS, reemplace el medio del plato de cultivo de queratocitos por una solución de desprendimiento de células 1X para una incubación de tres minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, reemplace la solución desmontable por un medio fresco completo y disocia las células con pipeteo suave. Luego, ajuste las células a la concentración adecuada para el revestimiento, y sembrarlas en el plato recubierto de ITS durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de tomar imágenes.
Para imágenes de tensión de integrina casi en tiempo real en células vivas, transfiera las células a la etapa de un microscopio de fluorescencia y seleccione el objetivo de 40 o 100 veces. En el software de imágenes, establezca el tiempo de exposición en un segundo y el intervalo de fotogramas de 20 segundos para obtener un vídeo de las imágenes ITS. A continuación, utilice un programa de software de análisis de imágenes adecuado para restar un fotograma anterior del vídeo ITS de un fotograma actual para calcular la señal ITS recién producida en el intervalo de fotogramas más reciente.
La señal ITS recién producida representa la tensión de integrina generada en el último intervalo de trama, reportando así la fuerza celular de manera casi en tiempo real. Aquí, el mapeo de tensión de integrina demuestra la inducción de la tensión de integrina en dos vías de fuerza durante la migración de queratocitos. La resolución del mapa de fuerza podría calibrarse para que sea de 0,4 micrómetros.
La alta tensión de integrina se concentra en el margen posterior en queratocitos de peces motiles. En las células no móviles, se forma un patrón de tensión de integrina específico que es muy diferente del observado en el queratocito de rápida migración. Las adherencias focales y la tensión de integridad de los queratocitos de peces se pueden co-imagen para evaluar la relación entre la tensión de la integrina y la estructura celular en las células de interés.
Con ITS, la fuerza de adhesión celular se hace visible con una resolución y una sensibilidad comparable a la imagen estructural celular. Esta técnica pavimenta el camino para el estudio de una interacción fuerza-estructura en las células.
