Las células adherentes ejercen fuerzas sobre su entorno, y esas fuerzas incluyen las fuerzas que las células ejercen sobre el sustrato, que se muestra aquí en verde, y las fuerzas que las células ejercen sobre sus vecinas, que se muestran en rojo. Estas fuerzas se pueden medir en monocapas celulares utilizando una técnica llamada microscopía de estrés monocapa. Brevemente, la técnica consiste en preparar hidrogeles que contienen pequeñas cuentas fluorescentes, justo debajo de la superficie superior, y grandes cuentas fluorescentes que están pegadas al vidrio.
En este hidrogel, uno ve las células y las cultiva para que confluyan o cualquier estado que uno desee para medir las fuerzas. La medición de las fuerzas requiere imágenes de la monocapa celular, tomando imágenes de luz transmitidas de las células e imágenes de luz fluorescente de las cuentas diminutas y grandes. Cada una de estas imágenes se adquieren en el mismo plano vocal.
Estas imágenes se adquieren cuando las células se unen y se separan del hidrogel. Y una comparación de estos dos conjuntos de imágenes nos proporciona los datos necesarios para cuantificar todas estas fuerzas. Ahí es donde AcTrM y AnViM entran en juego.
Después de colocar las celdas, para que pueda adquirir imágenes en la misma ubicación exacta, en cualquier instancia deseada, ese protocolo se programa en AcTrM y luego analizar estos datos y visualizar los resultados, ese es el propósito de AnViM. En los próximos minutos, lo guiaremos a través del proceso de adquisición de imágenes para una monocapa de células de confluencia. El paso cero de la acción solicita al usuario que seleccione el tipo de adquisición.
Una nueva adquisición para comenzar un nuevo experimento, o una adquisición continua para reanudar un experimento anterior. Haga clic en Nueva adquisición para crear una lista de posiciones. El paso uno de la acción enumera todos los pasos siguientes.
Y estas acciones se tomarán en la ventana de la lista de posiciones de etapa aquí. Haga clic en Live in Micro-Manager para visualizar la muestra para realizar ajustes manuales. En la vista en vivo, veremos la fase.
Aquí está claro. Ahora, uno tendrá que mirar las cuentas. Aquí, las cuentas se pueden visualizar en fluorescencia.
Así que seleccione el canal apropiado para las cuentas superiores. También es importante que pueda ver algunas cuentas inferiores, así que veamos un canal para las cuentas inferiores. Lo que ves aquí es una imagen borrosa de las cuentas inferiores, y eso está completamente bien siempre que puedas decir que las cuentas inferiores están allí, lo que puedes hacer en esta imagen.
Lista de posiciones, haga clic en Marcar. Así es como se crea una lista de posiciones. Después de crear una lista de posiciones, que se discutió en el video anterior, siga los pasos enumerados en el paso de acción dos usando la ventana de adquisición multidimensional.
Digamos que queremos realizar un largo lapso de tiempo. Aquí, voy a indicar el número de imágenes que queremos que se tomen. El primer canal va a ser el canal de fase.
El siguiente va a ser de las cuentas superiores y el siguiente va a ser las cuentas inferiores. Haga clic en Cerrar en la ventana de adquisición multidimensional y haga clic en Aceptar en el paso dos de AcTrM. La salida se guardará en el directorio identificado en la ventana de adquisición multidimensional.
El paso de acción tres preguntará si el experimento necesita recuperación. La respuesta suele ser sí. Aquí iTACS pregunta, ¿queremos realizar una recuperación refinada?
Esta primera parte nos va a acercar bastante a una recuperación refinada, pero la parte inferior nos va a acercar aún más a una mayor precisión de reposicionamiento. Si la recuperación se va a realizar utilizando un campo de visión limitado, se ofrece esta opción, pero para este experimento, no seleccionaremos esa opción. En este punto, la adquisición de un conjunto de imágenes de referencia está completa y Micro-Manager se puede cerrar.
Para la adquisición de imágenes, se iniciará AcTrM. Seleccione la ampliación y elija el directorio que contiene las carpetas de datos. Seleccione opciones para reposicionar la placa junto con el canal utilizado para el reposicionamiento.
Se proporciona una interfaz para hacer coincidir lo que se ve actualmente en la cámara con las imágenes guardadas. Si hay superposición, las imágenes mostrarán un color rojo y verde junto con el negro, y se puede realizar un ajuste manual. De lo contrario, presione aceptar y la adquisición continuará.
Ahora podemos comenzar FIJI. Seleccione la primera opción en el menú desplegable de MSM etiquetada como preprocesamiento. A continuación, seleccione la carpeta que contiene la carpeta tnimgs.
A continuación, tendremos que definir qué canal corresponde a qué imagen. Para este ejemplo, el canal 0 es la imagen de luz transmitida, que es la imagen de contraste de fase de las celdas. La imagen de la cuenta inferior es el Canal 2, y la imagen de la cuenta superior es el Canal 1.
Y luego, te pregunta dónde se cruzan las celdas y de qué lado de la imagen. En este caso, las celdas son una monocapa que avanza hacia el borde derecho por lo que anularemos la selección de Derecha, y continuaremos. Aquí, una pequeña región de cuentas superiores, ubicadas lejos de la monocapa, tienen el mismo propósito que las imágenes de cuentas inferiores que parecerían más escasas y más grandes que las que se muestran aquí.
Ahora nos pregunta si queremos cambiar el brillo y el contraste para que las cuentas aparezcan de manera prominente. Así que ajustamos usando las barras deslizantes en el menú, y una vez que las cuentas aparecen prominentes, haga clic en Aceptar. Y ahora, haremos la corrección de posición. Si hay algún cambio, se deshará de él.
Y una vez hecho esto, creará la carpeta de análisis. Dentro de la carpeta de análisis, creará la carpeta de posición, P0, y las elecciones que hicimos en los menús de preprocesamiento anteriores se almacenan en opciones de análisis, como qué bordes se cruzaron, el tamaño del píxel y qué imagen es contraste de fase y otros. En el menú desplegable Microscopía de esfuerzo monocapa o MSM, seleccione Deformación del gel MSM.
Desde aquí, seleccionaremos la opción que sea adecuada para nuestra distribución de cuentas. Y a medida que se procesan los datos, puede ver que ha aparecido una nueva carpeta de desplazamiento en la carpeta de posición. Aquí será donde se almacenarán todos los archivos de salida.
Esto indica que el análisis está completo. Vamos a ver cómo calcular las fuerzas que se ejercen a través de la unión célula-ECM y la unión célula-célula y también el citoesqueleto de las células individuales de la monocapa. Para eso, seleccione la tercera opción.
Y uno va a elegir el directorio que contiene tnimgs y la carpeta de análisis, lo que significa que uno seleccionará el directorio de ejemplo en lugar de cualquiera de estos directorios. Presione seleccionar, y le preguntará, ¿cuál es el módulo de corte de este gel? El módulo de cizallamiento es 1250 y el espesor del hidrogel en este ejemplo es de 118 micras.
El nivel de ruido previsto se proporciona aquí. Luego, hay un desplazamiento medio es la bandera cero, que no se verifica en este caso. Seleccione Aceptar y la implementación que calcula la tracción se ejecuta a través de una función de MATLAB, que es como se implementa en esta versión de AnViM.
Ahora está listo para hacer el cálculo de las fuerzas célula-célula o citoesqueléticas. Y la primera pregunta que hay que hacerse es, ¿es confluente la monocapa? En este caso particular, tenemos una monocapa que avanza y no hay una región de celda en el lado derecho del marco.
Así que la respuesta es que la monocapa no es confluente, así que vamos a decir que no. Ahora se nos pide que dibujemos un polígono alrededor del objeto no celular más grande. Seleccionamos los métodos adecuados para la segmentación.
Aquí nos está pidiendo que indiquemos el color de las células en los métodos tres y cuatro, por lo que aquí las celdas son negras por lo que elegiremos el negro. La segmentación que se produce a partir de estos diferentes métodos termina con algunos agujeros en la monocapa celular y algunas regiones blancas en el área sin células. Aquí podemos elegir, rellenar los puntos automáticamente y golpear OK.So ahora todos los puntos se llenan en la monocapa y sin área celular.
Y luego, calcularemos las tensiones mecánicas en la monocapa celular. Ya hemos realizado la primera parte donde segmentamos las células de la región sin células, por lo que comenzamos este paso con la segunda parte que es la segmentación de las células individuales y las imágenes. Uno va a seleccionar la segmentación para celdas individuales.
Y aquí nos pide que elijamos el directorio de posiciones. Y hay algo más de información dada aquí para estos parámetros. Luego le pide que dibuje un polígono alrededor de la celda normal más pequeña.
Entonces, lo que dibujas aquí se usa para calcular el área y va a estipular que cualquier cosa más pequeña que esto no se define como una celda. Y luego pide la célula más grande. Entonces dibujamos un polígono alrededor de la célula normal más grande, y luego pregunta, ¿cuál es más brillante?
¿Es la interfaz célula-célula más brillante o los centros celulares son más brillantes? Entonces, en este caso, la interfaz celda-celda es más brillante, así que voy a seleccionar la interfaz celda-celda. Así que esto indica que el cálculo se ha completado.
Comencemos seleccionando el mapa en las intensidades de las celdas. Primero, iTACS le pide al usuario que seleccione el directorio de posición, que también se conoce como la carpeta P0. Cuando haya terminado, haga clic en Seleccionar.
Luego se le pregunta al usuario si quiere que iTACS detecte la división celular o cuantifique la fluorescencia celular. En este caso, no tenemos ninguna proteína fluorescente dentro de la célula, por lo que elegiremos detectar la división celular. La siguiente diapositiva permite al usuario definir el tamaño de la región vecina, este es un análisis único que AnViM realiza donde observa las propiedades de las celdas individuales, así como las propiedades de las celdas de la región vecina.
Aquí, el usuario puede elegir el ancho de una región vecina de celdas. En este caso, definimos las regiones vecinas con 60 píxeles. La primera casilla de verificación pregunta si queremos que iTACS recopile propiedades de las celdas, sí lo hacemos, y esta casilla de verificación pregunta si queremos que iTACS recopile propiedades de los vecinos, sí, queremos que iTACS también lo haga.
Debajo de estas casillas de verificación, iTACS proporciona más información sobre las casillas de verificación si el usuario desea obtener más detalles sobre cada casilla de verificación. Esto indica que el análisis está completo. Una vez más, iTACS le pide al usuario que seleccione el directorio de posición.
Luego, el usuario tiene la opción de mapear datos de fuerza, crear imágenes de los datos de fuerza, mapear datos de velocidad y crear imágenes de los datos de velocidad. Es importante tener en cuenta que la creación de imágenes lleva tiempo, por lo que uno puede elegir hacerlo ahora o esperar para hacerlo más tarde. Es por eso que el usuario tiene la opción de seleccionar las opciones o no.
Aquí, iTACS le pide al usuario que determine el tamaño de la región vecina nuevamente, y puede usar el mismo tamaño que determinó para mapear intensidades, que era de 60 píxeles, en nuestro caso. Y de nuevo, se le pide al usuario que recopile las propiedades de las celdas, así como de su región vecina. Esto indica que el análisis está completo.
En el menú desplegable Microscopía de esfuerzo monocapa o MSM, seleccione datos de seguimiento de resultados. Primero, iTACS le pide al usuario que seleccione el directorio de posición, que también se conoce como la carpeta P0. Cuando haya terminado, haga clic en Seleccionar.
Aquí, iTACS pregunta desde qué número de trama desea el usuario que iTACS comience a rastrear datos. Es bastante seguro comenzar a rastrear desde el fotograma número dos, porque la velocidad no se puede determinar para el fotograma número uno. Aquí, iTACS le pide al usuario que indique el número máximo de parcelas a llenar simultáneamente.
Y esencialmente, esta es una forma de acelerar el seguimiento de datos. Cuando haya terminado, haga clic en Aceptar y las opciones para elegir variables durante el seguimiento se presentan de manera similar a las opciones para generar mapas de calor. Las propiedades comunes de interés se proporcionan en el cuadro de texto en la parte superior de la ventana.
Pero si desea personalizar sus variables, simplemente necesita eliminar todo en el cuadro de texto y seleccionar las propiedades específicas que se enumeran a continuación. En el menú desplegable Microscopía de esfuerzo monocapa o MSM, seleccione gráfico de resultados. Después de eso, iTACS le pregunta al usuario si el usuario desea limitar el trazado a celdas con pista ininterrumpida.
Si no desea limitar el trazado a pistas ininterrumpidas, haga clic en No.Pero si desea limitar el trazado a celdas con pistas ininterrumpidas, haga clic en Sí aquí iTACS pregunta cuántas variables desea que el usuario trace el programa. iTACS es capaz de trazar hasta tres variables, y en este caso, solo trazaremos dos variables para ver la relación entre esos factores. En el menú desplegable Microscopía de esfuerzo monocapa o MSM, seleccione imagen de resultados.
Aquí está el directorio de posición y, cuando haya terminado, haga clic en Seleccionar. iTACS luego nos pide que elijamos el marco inicial. Aquí, seleccionamos el fotograma número dos.
Las opciones para hacer mapas de calor se presentan de manera similar a las opciones para trazar pistas de tiempo de celdas individuales. Con eso, concluimos cómo hacer un mapa de calor. Aquí se representa el rastro de tiempo de la velocidad celular en la tensión citoesquelética para la célula número uno.
Las propiedades se muestran en un eje vertical compartido y el eje horizontal indica el número de instancia de tiempo, donde los fotogramas se adquieren a intervalos de 15 minutos. La segunda salida es una serie de mapas de calor una hora después del experimento. Las propiedades que se muestran aquí incluyen el área de propagación, la orientación, la circularidad, la velocidad, la dirección del movimiento, la orientación de la tensión máxima, la tensión citoesquelética, las tracciones del sustrato y la anisotropía de tensión de las células individuales.
Así que este es un vistazo a un conjunto de experimentos. Hay varias otras situaciones experimentales en las que AnViM y AcTrM pueden ayudar al usuario a realizar el experimento de manera reproducible y estos contactos se enumeran en el manuscrito. Algunas de las características clave de iTACS incluyen la automatización del protocolo experimental, el análisis automatizado de datos y no se requieren antecedentes de ingeniería.
