La microscopía de fuerza de tracción se utiliza para medir las fuerzas generadas por las células. Este protocolo simplifica el análisis de recogida de datos de fuerza de tracción, con el fin de hacerlo más accesible a los usuarios inexpertos. La principal ventaja de esta técnica sobre las plataformas de microscopía de fuerza de tracción sin referencia existentes, es que la litografía multifotonal permite un rediseño rápido y fácil de la configuración de modelado de acuerdo con las necesidades experimentales individuales.
Hay muchos pasos clave en la fabricación e implementación de esta nueva plataforma de tracción sin referencia que son más fáciles de entender a través de la representación visual en lugar de solo texto. Para la fotopolimerización del hidrogel base, agregue primero tres microlitros de la solución de prepolímero en una lámina delgada y plana de alcanos perfluoroalkoxi, y coloque tiras planas PDMS de 150 micrómetros de espesor que rodean, pero no en contacto con, la gota de solución de prepolímero. Coloque un cubreobjetos silanizados de acrilato en el PDMS, con la gota de prepolimero centrada debajo del cubreobjetos para aplanar la gota de prepolimero al grosor de los espaciadores PDMS.
Exponga la solución de prepolimero empareda a la luz UV durante aproximadamente un minuto. Cuando un hidrogel esté completamente formado, separe cuidadosamente el cubreobjetos de los espaciadores PDMS. Utilice adhesivo acrílico de doble cara de alto rendimiento para fijar una placa Petri de fondo abierto al cubreobjetos.
Tenga especial cuidado al adherir el cubreobjetos cargado de hidrogel al plato Petri. Un plato húmedo o muy poca presión durante la aplicación permitirá que se formen fugas, arruinando la muestra. Aplique presión a la superficie de contacto adhesiva para crear un sello completo entre el cubreobjetos, el adhesivo y la placa Petri, teniendo cuidado de no romper el vidrio.
Utilice PBS filtrado estéril para enjuagar el hidrogel. A continuación, agregue ocho microlitros de NVP a 800 microlitros de la solución de laboratorio preparada para la síntesis de hidrogel. Para convertir una imagen binaria en una máscara digital, abra MATLAB y abra y ejecute el runscript.
script m MATLAB. Seleccione el archivo TIF binario para la conversión y seleccione una carpeta para guardar los archivos de la región. Introduzca el tamaño final deseado en micras de la imagen seleccionada.
La imagen de entrada se escalará y se acotará para que coincida con estos parámetros. Para crear una matriz de un solo píxel, en Opciones del generador de región de interés, desactive la casilla Quitar tic en Regiones pequeñas/Píxeles únicos, active la casilla de tic Cuadrados y desactive Usar en Líneas de rotura horizontales. A continuación, haga clic en Aceptar. El archivo OVL se encuentra en la carpeta especificada anteriormente.
Abra el archivo en el software del microscopio y cargue las regiones deseadas que controlaron el obturador láser durante dos litografías de escaneo láser de fotón. Los siguientes pasos deben realizarse en condiciones con una luz mínima. Para la fabricación de matrices de marcadores fiduciales en condiciones de poca luz, mezcle a fondo 200 microlitros de la solución de laboratorio NVP previamente preparada con 20 miligramos de Alexa Fluor 633 y retire todo el PBS del plato que contiene el hidrogel.
Añadir la mezcla PEG-633 al hidrogel como una gota que engloba completamente el hidrogel base y cargar el plato Petri en el portacuchillas de la etapa del microscopio. A continuación, cubra el plato y deje que la solución de patrón se empape en el hidrogel durante al menos 30 minutos, protegido de la luz. Para configurar el microscopio para la toma de imágenes, seleccione los láseres y filtros adecuados para visualizar Alexa Fluor 488.
Localice el hidrogel utilizando la señal PEG-488 y bloquee la recolección de longitudes de onda de emisión más largas del detector. Utilice escaneos de teselas verticales y horizontales para localizar el centro del hidrogel en el plano XY y poner a cero el escenario en esta posición. Utilice escaneos de línea en la función Z-stack para localizar la superficie del hidrogel y poner a cero el foco en esta posición.
Nivele el hidrogel repitiendo los escaneos de línea lejos del centro XY para identificar la posición de la superficie, ajustando los tornillos establecidos para la etapa del microscopio, según sea necesario. Dentro del espacio de trabajo del software del microscopio, cree un archivo de experimento independiente para fotopatrón y establezca la potencia de varios fotones en 1,8% y la velocidad de escaneo en seis. Ajuste el tamaño del marco de la imagen y los píxeles para lograr un tamaño de píxel de 0,1 micrómetros por píxel y una relación de aspecto de 100 a uno y cargue el archivo de regiones en la pestaña de la región.
Utilice una macro para establecer todas las regiones que se adquirirá y activar la función Z-stack. Establezca el espaciado en 3,5 micrómetros para una profundidad total de 28 micrómetros y el número total de rodajas Z de nueve. A continuación, utilice la función Posiciones para establecer ubicaciones específicas en el hidrogel donde se fotopatrnará las matrices de marcadores fiduciarios.
A medida que el tiempo de remojo se acerca a la marca de 30 minutos, adquiera sucesivas exploraciones de línea Z-pila de la superficie del hidrogel cada cinco minutos para comprobar si hay hinchazón en función de los cambios en la ubicación de la superficie en relación con la posición de enfoque a cero. Si no se ha producido ningún cambio en la posición de la superficie durante el intervalo de cinco minutos, ejecute los ajustes de patrón y utilice el láser de 488 nanómetros para verificar que la superficie del hidrogel no se movió durante el patrón. A continuación, retire el hidrogel del microscopio, aspire la solución PEG-633 de la placa Petri y enjuague el plato con PBS filtrado estéril.
Para adquirir una celda e imágenes de marcadores fiduciarios, devuelva el plato Petri al portacuchillas para localizar las áreas con patrones. Localice una celda de interés y adquiera una imagen transmitida o fluorescente de la celda. A continuación, adquiera una pila Z de la matriz con patrones debajo de la celda como se ha demostrado y adquiera un segundo conjunto de imágenes transmitidas o fluorescentes de la celda.
Al recopilar una pila de imágenes, las imágenes resultantes deben mostrar una matriz regular de entidades con patrones que oscilan en intensidad en función de la posición Z dentro de la pila de imágenes. El rastreo. El script m proporciona varias imágenes de diagnóstico, incluyendo una proyección Z de los marcadores fiduciarios fluorescentes para evaluar la calidad de preprocesamiento, una gráfica de los centroides detectados, color codificado en función de la posición Z para evaluar la calidad de detección de objetos, y una gráfica de las pistas que representan los centroides marcadores detectados que se han vinculado en columnas en la dirección Z para evaluar la calidad de seguimiento del objeto.
El script DISP 3D.m proporciona una gráfica de intensidad en función de la posición Z para cada columna de entidades detectadas en una pila de imágenes determinada para evaluar la calidad de los perfiles de intensidad del marcador fiduciario. Ambos DISP 3D.
m y disp cizallamiento. m juntos proporcionan histogramas del ruido de desplazamiento medido en cada una de las dimensiones de coordenadas cartesianas, así como mapas de calor interpolados de desplazamiento. Además, el interp final3D_2.
m proporciona mapas de calor de las tracciones superficiales calculadas utilizando el código externalizado. Lo más importante a recordar durante este procedimiento es que las soluciones que contienen LAP son sensibles a la luz y deben protegerse tanto como sea posible de fuentes de luz ambiental. Recuerde que el NVP es un compuesto orgánico volátil y siempre debe ser manejado en una campana de flujo químico.
