Nuestro protocolo demuestra un flujo de trabajo preclínico completo para probar la eficacia terapéutica de las células madre pluripotentes inducidas por el hombre después de una lesión cerebral. Este modelo de lesión cerebral traumática proporciona un alto grado de versatilidad y reproducibilidad al controlar estrechamente los parámetros de la fuerza mecánica y, por lo tanto, proporcionar una lesión bien definida. Estos procedimientos se pueden utilizar para estudiar procesos de lesión y recuperación en otras regiones cerebrales y el método de trasplante es susceptible de usarse con muchos tipos de células.
La perforación craneal es un reto, ya que la técnica requiere destreza manual para dominar la presión, velocidad, profundidad y movimientos suaves adecuados. Documentar todos los eventos y la práctica extensamente. Para realizar una craniectomía unilateral, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del diente en el ratón anestesiado y asegure el ratón en un marco estereotaxico.
Aplique un pomada oftálmica antibiótica en los ojos con un hisopo de algodón estéril y una solución a base de yodo en la zona del cuero cabelludo afeitado. Retire el yodo con 70% de etanol y cubra al animal con una cortina quirúrgica fenestrada. Haga una incisión de línea media de 1,5 a dos centímetros en el cuero cabelludo y use hisopos de algodón estériles para limpiar la herida y limpiar la fascia izquierda de la línea media en el bregma.
Utilice una sonda impactador para identificar el sitio de la craniectomía y establezca la x es igual a cero, y es igual a punto de referencia estereotéruco cero a bregma. Ajuste la sonda lateralmente a dos milímetros a la izquierda de la línea media. Utilice un marcador quirúrgicamente seguro para colocar un círculo de cinco milímetros de diámetro alrededor del área de impacto presuntiva.
Levante y gire el impactador fuera de su posición y complete el círculo de cinco milímetros. Devuelva brevemente el impactador a su posición para verificar la precisión del círculo de cinco milímetros. A continuación, levante y gire el impactador fuera de su posición y utilice una herramienta de mano de microgódi rotativo de alta velocidad equipada con una broca de rebaba de punta redonda de 0,6 o 0,8 milímetros para hacer un agujero abierto en el cráneo a una velocidad máxima de 70 a 80%.
Aplique una ligera presión al cráneo mientras perfora a lo largo del contorno circunferencial de cinco milímetros dentro de este borde y utilice fórceps para levantar el colgajo óseo resultante. La perforación a través de líneas de sutura puede presentar dificultad adicional, ya que el hueso se interrumpe y requiere presión adicional. Los vasos sanguíneos pueden estar en estrecha asociación y, por lo tanto, es probable que se usen eventos hemorrágicos.
Para inducir una lesión de impacto cortical controlada leve, limpie la sonda impactador con una almohadilla de preparación de alcohol estéril y mueva la sonda impactador de nuevo a su posición sobre la corteza expuesta. Baje la sonda hasta que toque la superficie dura mater y marque esta posición como z es igual a cero. Retirar el pistón y pasar a z es igual a menos un milímetro y descargar el pistón para impactar la corteza.
Levante inmediatamente el pistón y mueva el brazo fuera de su posición e irrigue la corteza con un volumen generoso de solución salina y utilice puntos de sutura interrumpidos simples y sutura de seda 5-0 para cerrar la incisión del cuero cabelludo. A continuación, entregue 10 miligramos por kilogramo de Ciclosporina A mediante inyección subcutánea en el escrúpulo y coloque el ratón en una jaula postoperatoria precalerada limpia con monitoreo hasta la recuperación completa. Aproximadamente 24 horas después de la craniectomía, coloque el ratón de nuevo en el marco estereotaxico.
Cubra el ratón con la cortina quirúrgica fenestrated. Lava el lugar de la incisión con solución salina estéril para limpiar el sitio y aflojar las suturas. Utilice un hisopo de algodón empapado de etanol al 70% para esterilizar suavemente el lugar de la incisión y use pinzas finas y tijeras oftálmicas para eliminar las suturas.
Luego irrigar el sitio de cirugía y craniectomía con abundante solución salina estéril. En una capucha de bioseguridad de cultivo celular, arremolina suavemente o toque el tubo de las células para asegurar una suspensión celular homogénea. Utilice una micropipeta para cargar aproximadamente 7,5 microlitros de células en una jeringa de Hamilton a través del extremo del émbolo.
Sosteniendo la jeringa en un ángulo de 120 grados con el extremo del émbolo hacia abajo, inserte el émbolo teniendo cuidado de no introducir una burbuja de aire entre la suspensión y la punta del émbolo. Fije el conjunto de la junta a la aguja de la pipeta y conecte la aguja a la jeringa. Empuje el émbolo para mover la suspensión celular a la aguja de la pipeta y conecte la jeringa a la bomba de la jeringa estereotaxica.
Avance el émbolo para asegurarse de que el conjunto de la bomba de la jeringa funciona correctamente y mueva la aguja a las coordenadas para la inyección. Alinee la punta de la aguja con bregma y establezca las coordenadas x e y en cero. Mueva la punta de la aguja sobre la craniectomía a dos milímetros lateral y menos un milímetro posterior a bregma y toque la punta de la aguja a la superficie dura mater.
Levante ligeramente la aguja y luego haga una pequeña incisión en la duramadre en el lugar donde la aguja hizo contacto. Ajuste la coordenada estereotáctica a z es igual a cero y empuje el émbolo para confirmar que la suspensión celular está fluyendo adecuadamente antes de introducir la aguja en el cerebro. Introducir la aguja en el cerebro a una profundidad de z es igual a menos 1,4 milímetros para colocar el injerto en el borde de materia gris / materia blanca de la corteza profunda.
Inicie la bomba de la jeringa para infundir la suspensión celular durante un período de 15 minutos. Utilice un microscopio de larga distancia de trabajo para controlar la salida de la suspensión celular de irrigación del sitio de la cirugía con solución salina estéril durante la inyección para mantener la hidratación del tejido. Cuando todas las células hayan sido entregadas, retire lentamente la aguja de trasplante e irrigue el sitio de la cirugía con solución salina adicional antes de cerrar la incisión con nuevas suturas.
A continuación, brinde atención postoperatoria como se ha demostrado. Para una prueba de eliminación de cinta adhesiva, utilice primero un pequeño cuchillo de afeitar para cortar trozos de cinta eléctrica amarillos y rojos en tres por cinco tiras milimétricas en una superficie de vidrio lisa. Lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento durante al menos 30 minutos antes de la prueba y use un paño de manipulación para sujetar el ratón por el escrúpulo del cuello y la espalda de manera que el ratón mantenga las sierras delanteras lejos de su cuerpo y cabeza.
Utilice pinzas para colocar una tira adhesiva en la superficie plantar de cada pata delantera y utilice una presión de dedo delicada y consistente para fijar las tiras a las patas. Coloque rápidamente el ratón en un cilindro de plástico e inicie dos cronómetros cuando el ratón tenga las cuatro patas en la caja de pruebas de plástico. A continuación, utilice los dos cronómetros para registrar las latencias para el aviso de la pata izquierda, la extracción de la pata izquierda, el aviso de la pata derecha y la extracción de la pata derecha.
En este experimento piloto, la función de la extremidad delantera se comparó solo en la craniectomía, la lesión por impacto cortical controlado y los ratones ingenuos. Los ratones que se sometieron a cirugía mostraron un aumento transitorio de las latencias para notar estímulos adhesivos durante uno a tres días inmediatamente después de la cirugía y déficits postoperatorios transitorios en la eliminación de adhesivos de la parte delantera ipsilateral. Los ratones que se sometieron a un impacto cortical controlado, sin embargo, mostraron déficits significativos en el rendimiento motor en la parte delantera contralaterales a la lesión en comparación con ratones ingenuos fuera del día postoperatorio 28.
La inmunostaining de secciones cerebrales de ratón para antígeno nuclear humano revela que los injertos de células humanas se pueden distinguir claramente de los tejidos del huésped en lesiones SHAM y cerebros de impacto cortical controlado. Debe observar los procedimientos de seguridad estándar de laboratorio al manipular células humanas cultivadas y al manipular agujas de jeringa que entran en contacto con roedores o fármacos inmunosupresores. Las secciones del tejido cerebral se pueden analizar para la expresión de marcadores neuroinflamatorios, ya que es valioso saber cómo el injerto afecta la respuesta de la lesión del tejido huésped y viceversa.
Nos sorprendió encontrar sutiles diferencias sexuales en los resultados del comportamiento posterior a la lesión. Ahora estamos investigando si el sexo juega un papel en la respuesta neuroinmune a la lesión cerebral. Las manos firmes, la paciencia y la práctica son cruciales para desarrollar una buena técnica de craniectomía.
El daño colateral de una craniectomía inadecuada puede comprometer el área que deseas dirigirte para el trasplante celular.
