Los cultivos organotípicos de la corteza adulta humana son hasta ahora el único sistema para probar terapias con células madre para la corteza dañada que permite estudiar la interacción entre las células huésped humanas injertadas y humanas. Una terapia probada en modelos animales generalmente falla cuando se traduce a los entornos clínicos debido a las diferencias entre las células de roedores y humanas. Aquí, podemos estudiar las células injertadas, la supervivencia, la diferenciación y la funcionalidad en un entorno de humano a humano.
Esta metodología nos ayudará a comprender cómo funcionan los circuitos neuronales en el cerebro humano, y también estimulará la traducción de este conocimiento a los entornos clínicos para mejorar la recuperación funcional después del daño cerebral. Demostrando el procedimiento estarán Raquel Martínez-Curiel, estudiante de doctorado, y Costanza Aretio-Medina, estudiante de maestría, ambas de mi laboratorio. Para comenzar, coloque los insertos de cultivo en una placa de seis pocillos usando fórceps en el laboratorio de cultivo celular debajo de una campana ventilada.
Agregue cinco mililitros del medio cortical adulto humano en la parte inferior del inserto hasta que entre en contacto con la membrana. Evite la formación de burbujas y agregue dos mililitros del medio en la parte superior del inserto. Antes de transferir las rodajas de tejido a los insertos, equilibrarlos en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante al menos dos horas.
Recoja el tejido del paciente en la sala de operaciones en un recipiente de solución de corte congelada, burbujeada y triturada. Transfiera el recipiente cerrado en hielo inmediatamente al área de corte del laboratorio. Inspeccione el tejido y, teniendo en cuenta la orientación de la capa cortical, localice la mejor superficie para pegarlo a la etapa de corte del vibratomo.
Si es necesario, corte la superficie irregular con el bisturí para colocar el tejido en el escenario para una orientación óptima del corte. Luego, pegue el tejido al escenario con adhesivo tisular. Colóquelo en la cámara de corte e inmediatamente llénelo con una solución de corte fría y burbujeante.
Continúe el burbujeo durante todo el procedimiento de corte. Ahora corte las rodajas coronales o sagitales dependiendo de la orientación del tejido a la cuchilla como se describe en el manuscrito. Coloque las rodajas en la cámara de recolección con una solución de corte burbujeante a temperatura ambiente.
Una vez que se haya cortado todo el tejido, transfiera las rodajas a una placa de Petri estéril con solución de enjuague a temperatura ambiente para eliminar el exceso de sacarosa de las rodajas y transportarlas al laboratorio de cultivo celular. A continuación, coloque las rodajas de tejido individualmente sobre los insertos húmedos y sumergidos. Después de 24 horas, cambie el medio para eliminar cualquier resto de sacarosa u otras sustancias residuales del procedimiento de corte.
Después de dos semanas, use medio cortical adulto humano sin gentamicina. Retirar el medio del matraz de cultivo celular. En el séptimo día de diferenciación, separe las células GFP-lt-NES preparadas corticalmente agregando 500 microlitros de tripsina e incube durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, agregue un volumen igual del inhibidor de tripsina seguido de cinco mililitros de medio DDM. Vuelva a suspender las células, transfiera suavemente la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 300 G.Mientras tanto, transfiera la placa que contiene el tejido humano de la incubadora a la campana y retire dos mililitros de medios de la parte superior del inserto. Al final de la centrifugación, retire el sobrenadante, resuspenda las células en una matriz de membrana basal fría y pura y transfiera la pensión a un tubo más pequeño.
Recoja la suspensión celular en un capilar de vidrio frío conectado a una tetina de goma para succionar. Inyecte la suspensión celular como pequeñas gotas apuñalando la rebanada de tejido semiseco en varios sitios. Deje que el gel se solidifique a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Luego, transfiera la placa de la incubadora a la campana y agregue cuidadosamente dos mililitros de medio cortical adulto humano a la parte superior del inserto para sumergir completamente el tejido. El tejido cortical adulto humano agudo mostró la presencia de neuronas, oligodendrocitos y astrocitos que muestran una preservación óptima del tejido. El tejido mostró la expresión de los marcadores neuronales NeuN y Map2 después de dos semanas de cultivo celular.
El registro de pinza del parche celular completo mostró que las neuronas habían mantenido el potencial de membrana en reposo y la resistencia de entrada de membrana, comparable a las neuronas de preparaciones agudas. Las células eran ligeramente menos activas que en el tejido fresco, aunque la mayoría de las células fueron capaces de disparar al menos uno, si no múltiples, potenciales de acción. El tejido cortical agudo mostró la expresión de los marcadores microgliales Iba1 y Tmem119.
Después de dos semanas en cultivo, la microglía se volvió menos ramificada y adquirió una morfología más activada que en el tejido agudo. Cuatro semanas después del trasplante ex vivo, las células GFP-lt-NES injertadas exhibieron neuritas extendidas con arborizaciones extensas y complejas a lo largo de todo el cultivo organotípico. Casi ninguna célula injertada sobrevivió en tejido mal conservado.
Los desechos y el etiquetado inespecífico de anticuerpos en células muertas se observaron ampliamente en toda la rebanada humana. En el caso del trasplante exitoso, las células se volvieron funcionalmente activas y las neuronas maduras mostraron potenciales de acción repetitivos y a menudo espontáneos. El sodio rápido hacia adentro, las corrientes lentas de potasio hacia afuera y un cierto nivel de actividad sináptica indican la integración funcional del injerto con el tejido huésped cuatro semanas después del injerto.
Cuanto más rápido se procese el tejido humano una vez que está fuera de la sala de operaciones, mayor será la viabilidad del sistema y el éxito del procedimiento experimental.
