Con el creciente interés en las terapias celulares, se necesitan nuevos métodos para evaluar la funcionalidad de estas células. Este protocolo permite la evaluación in vitro a largo plazo de estos injertos celulares en un contexto neuronal. Las principales ventajas de esta técnica es que todos los componentes provienen de origen humano.
Además, el injerto se puede rastrear fácilmente y el entorno del organoide se puede cambiar fácilmente, lo que permite probar diferentes medicamentos o tipos de tratamientos. La demostración de esta técnica estará a cargo de Iliana Ibáñez, una talentosa estudiante de doctorado en mi laboratorio. Comience por eliminar la suspensión unicelular de las células madre pluripotentes inducidas o las células progenitoras neurales derivadas de iPSC, o NPC, del hielo y centrifugarlas a 300 g durante cinco minutos a 4 grados centígrados.
Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 3 miligramos por mililitro de matriz de membrana basal solubilizada para obtener un volumen final de dos microlitros por inyección. Vuelva a colocar inmediatamente la suspensión sobre el hielo hasta su uso. Transfiera la jeringa preenfriada del congelador a 20 grados centígrados a una cubeta de hielo para su uso posterior.
A continuación, retire la placa del organoide cerebral de la incubadora y transfiera el organoide a una placa de 35 milímetros con una punta de diámetro ancho. Para estabilizar los organoides y facilitar la inyección, retire el medio tanto como sea posible sin dañar el organoide. Coloque el plato de 35 milímetros que contiene el organoide bajo un microscopio de disección para facilitar la inyección.
Una vez que los organoides estén listos para inyectar, vuelva a suspender suavemente las células NPC marcadas con EGFP con una punta de pipeta P20 refrigerada y mueva dos microlitros de estas células a un portaobjetos de vidrio estéril previamente enfriado. Tome una jeringa de insulina precargada del hielo y extraiga lentamente los 2 microlitros de suspensión celular con el bisel de la aguja hacia abajo. Abra la tapa del plato que contiene el organoide antes de enfocar el microscopio sobre él.
Sostenga el plato con una mano, coloque el bisel de la aguja hacia arriba. Y con la otra mano, inyectar la célula lentamente en la superficie del organoide. Después de inyectar las células, vuelva a colocar la tapa en el plato e incube el organoide inyectado durante uno o dos minutos.
Luego, agregue suavemente 500 microlitros del medio organoide a la placa antes de transferir el organoide a una placa de 24 pocillos con una punta de orificio ancho. Incubar el organoide a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con un cambio completo del medio cada dos días. Cargue un organoide no inyectado o de control negativo en un microscopio de fluorescencia.
Y ajuste la intensidad de iluminación entre 1 y 2 y el tiempo de exposición entre 80 y 100 milisegundos para una autofluorescencia mínima. A continuación, cargue el organoide de control positivo y aumente el tiempo de exposición para asegurarse de que las células marcadas sean visibles. Vuelva a colocar el organoide con una punta de pipeta de diámetro ancho para encontrar la proteína fluorescente verde mejorada o la región EGFP plus para la inyección.
Retire el medio completamente del organoide antes de cargar el organoide. E imagínalo con la configuración seleccionada. Una vez que se complete la imagen, agregue inmediatamente un medio nuevo para evitar que el organoide se seque.
Después de repetir la eliminación del medio y la obtención de imágenes para todos los organoides, regrese los organoides a la incubación normal y a los cambios de medio. Repita la toma de imágenes a los intervalos deseados. Coloque el portaobjetos en un frasco de tinción de portaobjetos Coplin lleno de tolueno durante dos minutos y repita este paso.
Luego, transfiera el portaobjetos de vidrio a un frasco de tinción de vidrio para portaobjetos Coplin lleno de alcohol etílico al 100 % durante dos minutos. Y repita este paso antes de transferir el portaobjetos a un frasco Coplin lleno de agua durante dos minutos. Repita el lavado con agua.
Luego, coloque un recipiente de plástico en el baño de agua, asegurándose de que el plástico no toque el fondo del baño. Vierta el tampón de citrato dentro del recipiente de plástico y deje que alcance de 95 a 100 grados centígrados. Una vez que el tampón alcance la temperatura deseada, coloque los portaobjetos dentro del tampón y cubra sin apretar el recipiente con una tapa, dejando los portaobjetos dentro del baño de agua durante 30 a 40 minutos.
Después de la incubación, retire el recipiente de plástico del baño de agua y déjelo enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Lave los portaobjetos tres veces durante dos minutos cada uno con PBS. Retire el PBS con un pañuelo de papel sin tocar la muestra.
Prepare el tampón de permeabilización y llene con él un frasco de tinción de portaobjetos de vidrio. Sumerja los portaobjetos en el tampón de permeabilización e incube durante 10 minutos. Repita tres lavados de PBS durante dos minutos cada uno.
Luego, prepare la mezcla de tinción para cubrir cada muestra y agregue 25 microlitros al portaobjetos de organoide antes de incubar el portaobjetos a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, repita tres lavados de PBS durante dos minutos cada uno y elimine las sales enjuagando el portaobjetos con agua destilada dentro de un frasco de vidrio para teñir el portaobjetos. A continuación, agregue 10 microlitros de monturas líquidas y DAPI a cada muestra antes de obtener imágenes del portaobjetos con el microscopio de fluorescencia.
Al frasco de tinción Coplin de vidrio lleno hasta la mitad con tampón de enfriamiento 2X, agregue 45 mililitros de PBS y coloque los portaobjetos dentro de este frasco. Incubar el frasco durante la noche a 4 grados centígrados. Utilice la microscopía de fluorescencia para comprobar si los fluoróforos se apagaron eficazmente antes de repetir la tinción y la obtención de imágenes.
Se observó una clara dependencia de la dosis de la fluorescencia de GFP en el número de células de entrada, con una detección consistente de EGFP más parche celular a 10.000 células y más. Los organoides inyectados y los controles de los que se tomaron imágenes para la positividad de EGFP mostraron la persistencia del sitio inyectado durante el período de seguimiento de cuatro meses. Aparecieron parches celulares positivos para EGFP adicionales nueve días después del trasplante y persistieron hasta el punto final del estudio, lo que indica la migración de las células y la integración en sus nuevos sitios.
A mayor aumento, se observó una morfología neural clara con proyecciones largas en el organoide, lo que confirma la integración de las células inyectadas. La tinción inicial de una sola ronda confirmó la presencia de células EGFP plus en el lugar de la inyección, incluida una mezcla de células que conservaban el estado de NPC y aquellas que se habían diferenciado hacia un destino neuronal. Para el control y los organoides inyectados, se observaron muy pocos Nestin más NPCs, con una mayoría de TUJ1 más neuronas maduras inmaduras.
Las dos tinciones redondas dieron más detalles, revelando neuronas maduras alrededor de la mayor parte de la región externa del organoide, con áreas de neuronas inmaduras hacia el centro. Los astrocitos estaban presentes en los organoides inyectados y de control, y estaban intercalados alrededor de los bordes externos. El corte para el que se realizó la tinción de dos rondas en el organoide inyectado mostró una pequeña colonia satélite de EGFP más células alejadas del lugar de la inyección que habían adoptado el fenotipo de las neuronas maduras.
Algunas de estas colonias parecen estar cerca de los astrocitos. Sin embargo, ninguna célula EGFP más con superposición completa a la tinción de GFP sugirió que fueran adyacentes en lugar de generar los astrocitos por sí mismos. Cuando se está inyectando el organoide es que hay que evitar aplicar demasiada fuerza o hacerlo demasiado rápido, ya que se puede destruir el organoide por completo.
Por lo tanto, después del seguimiento de la vida útil, los organoides se pueden asociar y utilizar para el análisis de citometría de flujo o enfoques de secuenciación de células individuales. Esto nos permitirá conocer el estado molecular de las células. Esta técnica podría ser de gran utilidad para avanzar en la terapia celular de enfermedades neurodegenerativas, así como para modelar tumores cerebrales o metástasis.
