Este protocolo puede ayudar a los científicos interesados en la microscopía no lineal a comprender los componentes clave, la configuración y el procedimiento de alineación de un microscopio basado en la dispersión estimulada de Raman. Las principales ventajas de la microscopía SRS son sus capacidades para realizar imágenes sin etiquetas basadas en contraste vibratorio y adquirir una imagen en pocos segundos. La microscopía SRS ha llevado las imágenes sin etiquetas a nuevas alturas, especialmente estudios de estructuras biológicas complejas como los lípidos, que son fundamentales para las células y la arquitectura celular.
La señal SRS se detecta como un pequeño cambio en la intensidad del haz de la sonda y puede ser corrompida por el ruido. Por lo tanto, un signo preciso es crucial. Para empezar, alinee el OPO y los rayos láser de zafiro de titanio para que ambos lleguen al microscopio.
A continuación, coloque los detectores del sensor de posición del rayo láser en dos posiciones entre el espejo dicroico uno y el espejo seis. La primera posición se encuentra cerca del espejo dicroico uno y la segunda está cerca del espejo seis. Para cada posición, utilice los sensores para detectar las coordenadas X e Y del haz OPO.
Es importante destacar que las coordenadas X e Y del rayo láser de zafiro de titanio son del mismo OPO en ambas posiciones de los detectores del sensor. Si, en algunas posiciones, las coordenadas no coinciden, ajuste la inclinación del espejo adyacente para compensar. Siga este mismo procedimiento para alinear las posiciones de la viga de titanio-zafiro con respecto a OPO para el trayecto entre los seis y siete del espejo.
Instale un espejo adicional en un soporte flip-flop entre el espejo seis y siete y voltee el soporte del espejo para dirigir la viga al autocorrelador. Encienda el controlador de autocorrelator, inicie la aplicación de software en el ordenador que lo controla y ajuste el tornillo de ajuste de distancia de haz del autocorrelador a su posición normal en 8,35 milímetros. A continuación, detenga la viga de zafiro titanio y suelte y proyecte el haz OPO desde el espejo adicional hasta el espejo de entrada del autocorrelador.
Intente ajustar el espejo de entrada para maximizar la señal de pulso láser como se muestra aquí. A continuación, detenga la viga OPO y suelte y proyecte el haz de zafiro de titanio desde el espejo montado en el chancla hasta el espejo de entrada y en el autocorrelador. Repita el ajuste óptimo del haz hasta que se obtenga la señal de autocorrelador, que se muestra aquí.
Ahora, ajuste el tornillo de ajuste de distancia de la viga a la posición cruzada en 7,30 milímetros. Suelte ambas vigas y escanee la línea retardada para superponer las dos vigas. Obtenga la señal del correlator cruzado resultante, como se muestra aquí.
A continuación, voltee el espejo montado en la chancla para que los haces alcancen el espejo siete y el cabezal de escaneo del microscopio. Retire el condensador y utilice el botón de escape para retirar temporalmente la lente subjetiva 60x. A continuación, gire la boquilla para mover la lente subjetiva 60x fuera de la trayectoria óptica.
A continuación, monte el detector en la parte superior del microscopio utilizando el soporte mecánico externo. Conecte la salida del detector a través de un filtro de paso bajo de 50 ohmios a un osciloscopio. Ahora, encienda el procesador que controla el cabezal del escáner y proyecte el haz OPO en la cabeza del escáner del microscopio.
Supervise la señal OPO y maximice la potencia medida por el detector utilizando un traductor XY. A continuación, cambie el haz del láser OPO al láser de zafiro de titanio y verifique que también se obtenga una señal para el láser de zafiro de titanio. Esto indica que ambas vigas están bien alineadas.
Finalice la alineación del haz girando hacia atrás la boquilla para introducir la subjetiva de 60x. A continuación, utilice el botón de reenfoque en el microscopio para recuperar el enfoque finalizado a la lente objetivo del microscopio 60x. Finalmente, coloque el objetivo, con un aumento de 40x, en lugar del condensador sin tocar ni alterar la muestra.
Ajuste la potencia de los láseres Titanium-sapphire y OPO medidos antes del microscopio a 30 milivatios para ambos haces. A continuación, establezca la longitud de onda del láser OPO en un valor diferente, con respecto al anterior, de modo que la bomba y la sonda no estén en resonancia con la frecuencia vibratoria de las perlas. A continuación, suelte ambos haces, de modo que entren en el microscopio.
Ejecute el traductor computarizado de la línea de retardo de escaneado y registre la intensidad medida utilizando el amplificador de bloqueo para cada posición de la línea de retardo. Espere hasta que se complete el escaneo de la línea de retardo. Ahora, establezca la longitud de onda del OPO de nuevo en 1076 nanómetros, de modo que la bomba y la sonda estén en resonancia con la frecuencia vibratoria de las perlas.
Ejecute el traductor computarizado de la línea de retardo de análisis y espere hasta que se complete el análisis de la línea de retardo. Por último, establezca la posición de haz superpuesta obtenida y la línea de retardo para la próxima adquisición de imágenes de dispersión Raman estimuladas. Para optimizar la sincronización espacial de las vigas, comience por detener el haz de zafiro de titanio y reducir la potencia de OPO a ocho milivatios.
A continuación, conecte la lectura del detector a la tarjeta de adquisición de datos. Ejecute el programa de adquisición de datos junto con la consola de escaneo del microscopio. Cuando haya terminado, guarde el archivo y procese los datos para obtener una imagen como la que se muestra aquí.
A continuación, detenga el haz OPO y reduzca la potencia de zafiro de titanio a 2,5 a 4,5 milivatios. Conecte el detector con el amplificador de bloqueo y sus lecturas con la tarjeta de adquisición de datos. A continuación, vuelva a ejecutar el programa de adquisición de datos junto con la consola de escaneo del microscopio.
Cuando haya terminado, guarde el archivo y procese los datos para obtener una imagen como la que se muestra aquí. Introducir una pila de filtros entre el objetivo 40x y el fotodiodo para eliminar los pulsos de la bomba y adquirir sólo la señal de stoke. A continuación, ajuste la señal de la bomba a 810 nanómetros con una potencia focalizada de ocho milivatios.
Establezca la señal de la sonda en 1076 nanómetros con la misma potencia focalizada de ocho milivatios para investigar un enlace típico carbono-hidrógeno de poliestireno con un desplazamiento Raman de 3054 centímetros inversos. Conecte el detector con el amplificador de bloqueo y la lectura del amplificador de bloqueo a la tarjeta de adquisición de datos. Por último, establezca el formato de píxel y el tiempo de adquisición en el programa de microscopio y ejecútelo y el sistema de adquisición de datos, guardando el archivo de matriz una vez que se haya completado.
Aquí se muestra una medida de ejemplo desde un único punto de la muestra. Cuando el haz no se solapa en tiempo o espacio, el resultado obtenido es fuera de resonancia, donde la amplitud de la señal, medida por un amplificador de bloqueo, es cero. La fase de esta señal, sin embargo, salta entre valores negativos y positivos.
Si las vigas se superponen en el espacio, la señal aumenta y alcanza su máximo cuando las vigas están perfectamente superpuestas en el tiempo, mientras que la fase comienza a alcanzar un valor fijo durante el tiempo en el que las vigas se superponen. En una imagen de transmisión, se utiliza un solo haz y la intensidad del haz transmitido de la muestra se mide mediante un fotodiodo. A la izquierda, la imagen de transmisión se obtuvo utilizando OPO, mientras que a la derecha, la imagen de transmisión se obtuvo utilizando titanio-zafiro.
Aquí se muestra un ejemplo típico de una imagen SRS, en el que se informan imágenes sin etiquetas de perlas de poliestireno con diámetros de tres micrómetros. Para obtener una imagen de alta calidad, basada en la microscopía SRS, la alineación de un microscopio es fundamental. Por lo tanto, todos los pasos indicados en el protocolo deben llevarse a cabo cuidadosamente.
