Este trabajo fue financiado por el premio de la NSF DBI 0852891. Parte de este trabajo también fue financiado por el Centro de Ciencia y Tecnología Biofotónica, uno designado Ciencia NSF y el Centro de Tecnología gestionado por la Universidad de California, Davis, en virtud del Acuerdo de Cooperación No. PHY0120999.

1. Algunos se debe tener cuidado en la preparación y la colocación de una muestra de Raman dentro de este sistema. <ol><li> Debido a que normalmente el sistema hace uso de los objetivos de la apertura numérica muy alta con distancias de trabajo muy corto, las muestras se colocan en un portaobjetos. Las muestras biológicas se colocan normalmente en un cubreobjetos espesor N º 1 montado en una cámara de celular Attofluor (Invitrogen, Carlsbad, CA). </li><li> Las muestras líquidas, en particular los tóxicos para los humanos, se colocan en una pequeña botella de vidrio con un cubre consolidó con la apertura por medio de un epoxi de silicona. La botella se invierte para la medición. </li><li> Debido a que nuestro sistema depende del momento preciso de la bomba y los pulsos de la señal, nos vemos obligados a no utilizar el ajuste del enfoque convencional de nuestro microscopio, que se traduce en el objetivo arriba y hacia abajo. Esta suma y resta de camino óptico de nuestro sistema. En su lugar, ponemos nuestras muestras en un escenario secundario montado en la parte superior de la platina del microscopio que tiene su propio control enfoque independiente. </li></ol> 2. A fin de tener tiempo-dependientes espectros Raman, el haz de excitación debe estar debidamente preparado. <ol><li> Comenzamos con la luz que emerge de un 2,4 W sintonizable pulsado Ti: Sapph láser (Chameleon, un sistema coherente, Santa Clara, CA). Cada pulso en el tren de pulso de 80 MHz con 30 nJ de energía, tiene una anchura de 140 fs temporal, y tiene un espectro centrado en 808 nm con un ancho de banda espectral de ~ 6 nm. </li><li> Para evitar copias de los reflejos de volver a entrar en la cavidad del láser, la luz pasa a través de un aislador de Faraday. Una placa de media onda colocado antes de que el aislador de Faraday permite el ajuste continuo de la potencia total enviado en el sistema. </li><li> Debido a 6 nm es demasiado amplio ancho de banda para resolver la mayoría de los modos Raman, el haz se envía a través de un filtro de banda muy estrecha (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) centrado en 808 nm. </li><li> La luz es enfocada por un doblete acromático (f = 100 mm) en un 5 mm β-borato de bario (BBO) cristal (CASIX, Fuzhou, Fujian, China) reducir a la mitad la longitud de onda de 808 a 404 nm nm. El cristal BBO se coloca en un soporte con la punta y controles de inclinación, y también se monta en una etapa de traducción. Para maximizar la eficiencia de la conversión de longitud de onda, el cristal debe ser colocado con precisión simétrica con respecto al enfoque del doblete, y con su eje de cristal alineados con la polarización del haz incidente. </li><li> Debido a la eficiencia de la conversión de longitud de onda es dependiente de la polarización, el control sobre la cantidad de luz emitida a la muestra se puede obtener mediante la colocación de un segundo de media onda después de la placa aislante de Faraday. Al girar este waveplate, la intensidad de la luz enviada a la muestra se puede ajustar de forma independiente de la intensidad enviado en el haz de la bomba (que trataremos más adelante). </li><li> La longitud de onda de la luz es convertida recollimated por un doblete acromático segundo (f = 500 mm) elegirse de forma que el haz de salida es lo suficientemente grande como para llenar la apertura posterior del objetivo del microscopio, y se dirige en un microscopio invertido (IX-71, Olympus, Center Valley, PA) a través de dos espejos de dirección. </li><li> El objetivo del microscopio, siendo el elemento óptico ubicado en el componente más monolítica del sistema, define el eje óptico. Para alinear el haz de excitación a este eje, se coloca un espejo en el plano de la muestra del microscopio. Los dos espejos de dirección son entonces iterativamente ajustado observando la parte de atrás-se refleja en un rayo láser CCD cámara de la época (μEye, IDS, Obersulm, Alemania) conectado al puerto de imágenes del microscopio. Suponiendo que la imagen de la cámara se centra en el microscopio de campo de visión, el haz se encuentra en el eje cuando el punto focal se centra en el chip del microscopio y la traducción de los objetivos a lo largo del eje z no cambia el punto central del haz desenfocado. </li><li> Cuando una muestra se coloca en el plano de la muestra y se irradia con luz láser Raman produce. Un filtro dicroico colocado debajo del objetivo del microscopio separa la longitud de onda de la luz-cambió Raman dispersos (y fluorescencia) del haz de excitación, la dirección de la luz Raman dispersos en el puerto lateral del microscopio. El microscopio fue modificado para eliminar las lentes dentro de su camino, de tal manera que la luz de la señal sale del microscopio colimado. </li><li> Debido a que el haz de señal que sale del microscopio es más grande que la apertura clara de los polarizadores Glan-Thompson, un telescopio de 0.47x construida con dos dobletes acromáticos (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) se utiliza para reducir el tamaño del haz. </li><li> La luz de señal es polarizada por un polarizador Glan-Thompson orientado a 0 ° con respecto a la vertical en el marco del laboratorio, y se dirige a un espejo dicroico donde se recombina con el haz de bombeo. </li></ol> 3. Para que la puerta óptica para operar a su máxima eficiencia, se debe tener cuidado en la preparación de la viga de la bomba (Kerr rayo), así. <ol&gt; <li> El pulso de bombeo es magnificado por primera 0.35x con un telescopio construido con dos dobletes acromáticos (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm) para que coincida con el tamaño final de la viga de la señal. </li><li> El haz de bombeo se envía en una línea de retardo compuesto por un prisma de ángulo recto colocado en una etapa de traducción lineal que se puede ajustar para asegurar la coincidencia temporal de la bomba y los pulsos de la señal (de ajuste que se discutirán más adelante). </li><li> Después de la línea de retardo, el haz se envía a través de una placa de media onda y el polarizador orientado a 45 ° con respecto a la vertical en el marco del laboratorio. Esto asegura que el estado de polarización del haz adecuado de la bomba cuando se alcanza el medio no lineal. </li><li> La luz es reflejada por dos espejos de dirección, con un piezo-eléctricos de control, que se utilizan para ajustar con precisión la posición del haz de bombeo de tal manera que se superpone espacialmente con el haz de señal. La superposición se obtiene mediante la observación de la bomba y las vigas de la señal en dos lugares, uno cerca y un lejos del espejo dicroico, donde las vigas se combinan. Al utilizar el espejo de dirección primero de los dos haces se superponen en el punto próximo, y el espejo piezo a la superposición de las vigas en el punto más alejado, el haz de bombeo se puede hacer exactamente alineados con el haz de señal. </li><li> Con los dos haces combinados, la puerta de Kerr y el sistema de recolección están preparados para maximizar el tiempo-dependientes recogida de la señal. </li></ol> 4. Con los dos haces combinados, la puerta de Kerr y el sistema de recolección están preparados para maximizar el tiempo-dependientes recogida de la señal. <ol><li> Las vigas de la bomba y la señal se pasa primero por un filtro dicroico que tiene un diámetro exterior de 6 a 404 nm para evitar que la luz de excitación residual de la dispersión Raman emocionante en el medio no lineal. </li><li> La bomba y las vigas de la señal son entonces los dos se centró por un doblete acromático (f = 35 mm) en una cubeta de 1 cm paso de luz de cuarzo que contiene el material no lineal. Cualquier material no lineal con un alto índice adecuado no lineal (superior a CS 2), y la respuesta temporal adecuada a corto (&lt;2 ps), se pueden utilizar aquí. Para estos experimentos, se utiliza disulfuro de carbono, CS 2, que tiene un índice no lineal n 2 = 3,1 x 10 -18 m 2 / W. La luz se recollimated por un doblete en segundo lugar con una distancia focal idéntica a la primera. </li><li> Las vigas se pasan a través y Glan-Thompson analizador en un montaje giratorio, y luego a través de un conjunto de filtros de absorción y la interferencia que combinados tienen un diámetro exterior de 10 a 808 nm. </li><li> Finalmente, la señal de luz es enfocada por un doblete acromático (f = 35 mm) en un 50 micras de fibra óptica multimodo, donde se monta la fibra en una etapa que permite la traducción de x, y, z. La fibra se acopla a un espectrógrafo de imágenes comerciales con cámara CCD adjunta (SP2300i Pixis y 100B, respectivamente, ambos fabricados por Princeton Instruments, Trenton, NJ). </li><li> Para alinear el sistema de recolección para maximizar la señal recogida, el analizador se ajusta a 0 ° y una muestra de tolueno se coloca en el plano de la muestra. Mediante el ajuste de la x, y, z de los controles y el monte de fibra, la señal recogida Raman se ha optimizado. </li><li> Para garantizar la correcta superposición espacial y temporal de la bomba y las vigas de la señal, se coloca un espejo en el plano de la muestra del microscopio. El filtro de 404 nm es eliminado del sistema. Con el analizador de girar hasta 90 º el haz de 404 nm retrorreflejada se envía en el espectrógrafo con la intensidad ajustada de tal manera que no se satura la cámara. Con el haz de bomba, el analizador se gira para reducir al mínimo la señal de 404 nm de transmisión. Con el haz de bombeo se vuelve a encender, la etapa de retraso es poco a poco ajustado hasta que la transmisión de la luz 404 nm comienza a aumentar. Luego, por la etapa de ajuste iterativamente demora, el espejo piezo-eléctrico, y la x, y, z y los controles de la fibra, una maximiza la señal. </li><li> Debido a que la retro-reflejado 404 nm y el haz de la luz dispersada Raman puede tomar caminos ligeramente diferentes a través del sistema, los ajustes finales se realizan mediante la colocación de una gran dispersor de Raman (como el tolueno) en el escenario de la muestra y el ajuste ligeramente la alineación al cambiar la fase de retardo, espejo piezeo-eléctrica, y x, y, z controles de la fibra para optimizar la señal Raman. </li></ol> 5. La recolección de una sola vez-gated espectro Raman requiere la adquisición de varios espectros para corregir los artefactos del sistema. <ol><li> Con el analizador a 0 °, el haz de excitación en el haz y bomba, un &quot;ungated&quot; espectro se toma, lo que representa el espectro que se puede adquirir sin el beneficio del sistema de tiempo de activación periódica. </li><li> Con el analizador de establece en 90 °, el haz de excitación y el haz de bombeo sigue apagado, un espectro de fondo se toma, lo que representa la cantidad de luz difusa se escapa a través de los polarizadores y otros elementos en el sistema. </li><li> Con el analizador restante a 90 °y todas las vigas, la &quot;puerta&quot; del espectro se toma, en representación de la luz Raman dispersos permite a través de los polarizadores cruzados por la presencia de la viga de la bomba. </li><li> Finalmente, con el analizador aún a 90 °, el haz de excitación fuera y el haz de bombeo en un espectro de fondo segunda está tomada, lo que representa la contribución a la &quot;puerta&quot; espectro de cantidades residuales de la luz 808 nm de entrar en el espectrógrafo. </li><li> Además, un espectro se toma con todos los láseres de, la caracterización de la línea de fondo &quot;oscuro&quot; nivel de la señal de la cámara y la electrónica. </li><li> Debido a que el espectro de frecuencia requieren largos tiempos de integración, es imprescindible romper este tiempo de integración en varias piezas (frames) para permitir la corrección adecuada de los rayos cósmicos - un problema común en la adquisición de datos a través de lapsos de varios minutos. </li></ol> 6. Una vez adquirido, varios pasos de procesamiento son útiles para mejorar la calidad y el aspecto de los datos. <ol><li> En primer lugar, todos los espectros son de color corregido restando de la &quot;oscuridad&quot; del espectro. </li><li> Para corregir los rayos cósmicos, los marcos de varios constituyen una adquisición se comparan entre sí sobre una base píxel por píxel. Para cualquier píxel de cualquier cuadro que se encuentra fuera de 2 desviaciones media del valor de la mediana de ese píxel en todos los fotogramas, el valor de ese píxel se sustituye por el valor de la mediana en todos los fotogramas. </li><li> Los marcos de los rayos cósmicos corregido se promedian y suavizada por un filtro Savitzky-Golay 1. </li><li> Para extraer el &quot;verdadero&quot; espectro cerrada, se resta la &quot;excitación-only&quot; y &quot;bomba de sólo&quot; espectro del espectro medido cerrada. </li><li> Finalmente, los espectros de una verja y luego se ungated con corrección de fondo restando un 5 º orden polinomio, determinó utilizando el método de Lieber y Mahadevan-Jansen 2. </li></ol> 7. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagrama esquemático del sistema de gating Kerr. La trayectoria del haz de la bomba se muestra en rojo, mientras que la ruta de los grupos de autoayuda se muestra en azul. La ruta donde Raman y de fluorescencia se solapan se muestra en verde, mientras que la ruta donde ha sido el de fluorescencia temporal filtrado se muestra en amarillo. Abreviaturas de la siguiente manera: BPF, filtro pasa banda, CCD, dispositivo de carga acoplada, DCM, espejo dicroico, FI, Faraday aislador; λ / 2, placa de media onda, LPF, filtro de paso largo, mediano NLM, no lineal, p, polarizador ; cristal de SHG, la segunda generación de armónicos. <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2 Arriba:. Espectros primas de cumarina disuelto en aceite de inmersión. Curva roja muestra el espectro tomado con la puerta abiertos (analizador de conjunto para la transmisión máxima). Curva en negro muestra el espectro tomado con el analizador de alineado de transmisión mínima y una bomba de rayo aplicada (el espectro cerrada). Curva azul muestra la spectum tomada con el analizador alineado para la transmisión mínimo y no se aplica la bomba de rayo (la puerta se mantiene cerrada). Curva verde muestra el espectro tomado con sólo el haz de bombeo aplicada. Líneas discontinuas indican magenta región espectral se muestra en el panel de abajo. Todos los espectros han sido suavizados con un punto de 11, 3 º fin de Savitzky-Golay filtro. Abajo: Los espectros de cumarina disuelto en aceite de inmersión después de fluorescencia de la sustracción de fondo. Curva roja es el espectro con la puerta abiertos, y la curva azul es el espectro de acceso controlado. El espectro cerrada muestra claramente el alto número de onda complicada pico característico de los aceites.

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El campo de la espectroscopia Raman biomédica ha visto un creciente interés en los últimos años como resultado de su potencial demostrado para la solución de varios problemas difíciles en el diagnóstico biológico. Por ejemplo, los espectros Raman se ha demostrado que tiene valor diagnóstico en la detección del cáncer de 3, 4, 5, 6. La espectroscopía Raman se ha utilizado también en la cuantificación de bacterias 7, 8 y 9 bacteriana respuesta a los fármacos. Se ha encontrad...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Lentes </td><td> Thorlabs </td><td> Varios </td><td> Todos los lentes con recubrimiento de tener pérdidas de transmisión máxima de 1% cada uno </td></tr><tr><td> Ajustable Ti: Sapph láser </td><td> Coherente </td><td> Camaleón </td><td> 30 NJ, 200 fs, 80 MHz </td></tr><tr><td> 40X objetivo de inmersión en aceite </td><td> Olimpo </td><td> UApo/340 </td><td> NA = 1,35 </td></tr><tr><td> Microscopio invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX-71 </td><td> Modificado para eliminar todos los objetivos secundarios en el puerto </td></tr><tr><td> La mitad de la placa de onda </td><td> Thorlabs </td><td> AHWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> Glan-Thompson polarizador </td><td> Thorlabs </td><td> GTH10M </td><td> ~ 10% de pérdida de transmisión </td></tr><tr><td> Espectrómetro </td><td> PI Acton </td><td> SP2300i </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> PI Acton </td><td> Pixis 100B </td><td></td></tr><tr><td> Software mathmatical </td><td> The MathWorks </td><td> MATLAB </td><td> versión 2008a </td></tr><tr><td> Faraday aislador </td><td> EOT </td><td> BB8-5I </td><td></td></tr><tr><td> Piezo-eléctrico espejo </td><td> Newport </td><td> AG-M100 </td><td></td></tr><tr><td> BBO cristal </td><td> CASIX </td><td> costumbre </td><td> 1 mm de espesor </td></tr><tr><td> Paso de banda de filtro 1 </td><td> Andover </td><td> 008FC14 </td><td> 808 ± 0,4 nm </td></tr><tr><td> Espejo dicroico </td><td> Semrock </td><td> FF662-FDI01 </td><td> borde de la banda a 662 nm </td></tr><tr><td> Largo del filtro de paso </td><td> Semrock </td><td> BLP01-405R </td><td> borde de la banda a 417 nm </td></tr><tr><td> Paso de banda de filtro 2 </td><td> Semrock </td><td> FF02-447/60 </td><td> 417-447 nm </td></tr><tr><td> CS 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 335266 </td><td> 99% de pureza </td></tr><tr><td> Cumarina 30 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 546127 </td><td> 99% de pureza </td></tr><tr><td> Inmersión en aceite </td><td> Cargille </td><td> 16242 </td><td> Tipo de DF </td></tr></tbody></table>

rejection of fluorescence background in resonance and spontaneous raman microspectroscopy

Espectroscopia Raman es con frecuencia plagados de un fondo fluorescente intensa, particularmente para las muestras biológicas. Si la muestra se excita con un tren de pulsos ultrarrápidos, un sistema que puede separar temporalmente la superposición de señales de espectro en una escala de tiempo de picosegundos puede aislar rápidamente llega la luz Raman dispersada por que llegan tarde de luz fluorescente. Aquí hablamos de la construcción y operación de un complejo sistema no lineal óptico que utiliza todas las ópticas de conmutación en la forma de una puerta ópticas de bajo consumo Kerr para aislar las señales de Raman y de fluorescencia. A solo 808 nm láser con 2,4 W de potencia media y la tasa de 80 MHz se divide la repetición, con aproximadamente 200 mW de luz 808 nm se convierten en &lt;5 mW de luz 404 nm enviado a la muestra para excitar a la dispersión Raman. El resto de la luz convertida nm 808 se envía a un medio no lineal, donde actúa como la bomba para el obturador totalmente ópticas. El obturador se abre y se cierra en 800 fs con la máxima eficiencia de aproximadamente el 5%. El uso de este sistema en el que son capaces de separar con éxito las señales de Raman y de fluorescencia a una velocidad de 80 MHz utilizando la repetición de impulsos y energías potencias medias que permanecen biológicamente seguros. Debido a que el sistema no tiene capacidad de reserva en términos de potencia óptica, que las consideraciones de varios detalles del diseño y la alineación que ayudan a maximizar el rendimiento del sistema. También se analiza el protocolo para la obtención de la superposición espacial y temporal de la señal y las vigas de la bomba en el medio Kerr, así como un protocolo detallado para la adquisición del espectro. Finalmente, se presenta un representante de los resultados de algunos espectros Raman obtenidos en presencia de fuerte fluorescencia utilizando nuestro tiempo-gating sistema.

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Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Se discute la construcción y operación de un complejo sistema no lineal óptico que utiliza ultrarrápida totalmente ópticas de conmutación para aislar Raman de las señales de fluorescencia. El uso de este sistema en el que son capaces de separar con éxito las señales de Raman y de fluorescencia utilizando las energías de pulso y potencias medias que permanecen biológicamente seguros.

El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

rejection-fluorescence-background-resonance-spontaneous-raman

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JoVE Journal

Bioengineering

13.0K vistas.  University of California, Davis. Se discute la construcción y operación de un complejo sistema no lineal óptico que utiliza ultrarrápida totalmente ópticas de conmutación para aislar Raman de las señales de fluorescencia. El uso de este sistema en el que son capaces de separar con éxito las señales de Raman y de fluorescencia utilizando las energías de pulso y potencias medias que permanecen biológicamente seguros.

Video: Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Imágenes de fluorescencia vida de rotores moleculares en las células vivas

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Investigación

Bioingeniería

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

La luminiscencia de energía de resonancia de transferencia para estudiar cambios conformacionales en proteínas de membrana expresado en células de mamífero

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Formación espontánea y cambio de redes de nanotubos lipídica Artificial como un modelo Bottom-Up de retículo endoplasmático

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...