Nuestro protocolo presenta una microscopía óptica multimodal, no lineal y la aplica para realizar imágenes químicamente específicas de nanopartículas de oro en células cancerosas. La principal ventaja de nuestro sistema de imágenes es que se puede utilizar para revisar el contraste biomolecular de estructuras celulares y nanopartículas de oro de manera multimodal. Para comenzar, encienda los enchufes de todos los equipos, excepto la caja de control remoto.
Luego, encienda la parte posterior de la caja y presione Iniciar operación después de que la luz remota se vuelva azul en la caja de control. Luego, encienda la PC del microscopio de escaneo láser y ejecute el software del microscopio confocal. Luego, verifique la trayectoria de la luz del microscopio usando el software de la computadora y controle el enfoque a través de la pantalla táctil o las perillas del control remoto o el software de la computadora.
Seleccione la configuración de imagen deseada en el software, incluido el zoom, el tamaño de imagen en píxeles y el tiempo de permanencia de píxeles, al tiempo que se asegura de que el tiempo de permanencia en píxeles sea mayor que el tiempo de integración. Coloque una gota de agua destilada encima del objetivo de inmersión en agua que enfoca los rayos láser en la muestra y entre el condensador y la muestra para obtener imágenes. Luego, ajuste la altura del condensador a aproximadamente un milímetro por encima de la muestra para recoger la cantidad máxima de luz y mueva el detector SRS colocado en un soporte móvil fuera de la trayectoria del haz para enfocar la muestra usando luz blanca.
Usando la configuración del software, seleccione el haz de la bomba y cambie la longitud de onda del láser a 802 nanómetros para vibraciones CH y 898 nanómetros para el pico de amida I, lo que representa grandes cambios en el cambio Raman. Para lograr pequeños ajustes en el cambio Raman, escanee la etapa de retardo en la unidad SFTRU como se describe en el manuscrito. Para el conjunto de datos hiperespectrales, seleccione la pestaña Desencadenador, haga clic en Iniciar por activador ttl activado y, a continuación, seleccione Desencadenar cada fotograma.
A continuación, en la pestaña Serie, active la serie temporal y la serie Z desactive. Además, establezca el número de fotogramas en la serie temporal para que coincida con el número de pasos en el software ATM. A continuación, vaya a la pestaña Ejecutar en el software ATM y establezca las posiciones de la etapa de retardo para CH en 90.25 y 92.25, mientras que para la región de amida I en 89 y 91 en milímetros, correspondientes a la posición de inicio y parada del escaneo hiperespectral, mientras se asegura de que el número de pasos coincida con el número de cuadros en el software de la computadora.
Después de verificar la configuración correcta, inicie la pila hiperespectral en el software de la computadora yendo primero a Adquirir y luego haciendo clic en Iniciar escaneo. Luego, en el software ATM, haga clic en Inicio, que inicia la recopilación de una serie de imágenes con aumentos incrementales en la posición de la etapa de retardo entre las posiciones de inicio y parada seleccionadas. Luego, tome una serie temporal de imágenes en diferentes posiciones de etapa de retardo para generar un escaneo hiperespectral.
Utilizando la unidad analógica, envíe y reciba señales ttl hacia y desde el sistema SFTRU para sincronizar la adquisición de imágenes y el movimiento de la etapa de retardo. Para cambiar entre imágenes en la región vibratoria CH a la región vibratoria amida I, cambie la longitud de onda de la bomba en el software láser de 802 nanómetros a 898 nanómetros. Además, cambie la configuración de dispersión de Stokes en el software ATM de 30 milímetros a 5 milímetros.
Ajuste la perilla inferior en el soporte del espejo para realizar un pequeño ajuste en el espejo en la vía de dispersión del haz de la bomba dentro de la caja SFTRU cambiando el ángulo del espejo con una cantidad incremental. Para validar la selectividad química de las microesferas de poliestireno, se registraron la dispersión Raman estimulada hiperespectral y los espectros Raman espontáneos. Los espectros fueron idénticos excepto por la diferencia observada en la intensidad relativa.
La imagen de dispersión Raman estimulada de células cancerosas 4T1 se realizó en números de onda 2, 852, 2, 930 y 2, 968, correspondientes a la banda vibracional de estiramiento carbono-hidrógeno de biomoléculas de lípidos, proteínas y ADN. Se realizaron imágenes multimodales de células cancerosas 4T1 dosificadas con nanopartículas de oro para investigar las distribuciones de nanopartículas en las células cancerosas. Las imágenes de dispersión Raman estimuladas adquiridas se obtuvieron para el canal CH2 y CH3, las sondas fluorescentes LysoTracker y el canal de dispersión Raman estimulado por resonancia fuera de resonancia.
Lo más importante a recordar es cambiar la región vibratoria, la referencia de la bomba, en el software láser y también la configuración de dispersión de Stokes durante el protocolo. Este sistema se puede cambiar fácilmente de la región de femtosegundo a la región de picosegundos sin afectar la alineación óptica. Esta capacidad nos permite realizar espectroscopía de sonda de bombo y dispersión Raman coherente con múltiples fotones y sus aplicaciones.
Esta plataforma de imágenes multimodales proporciona nuevos conocimientos sobre nanomedicina y allana el camino para la obtención de imágenes moleculares de células, tejidos y nanopartículas de oro.
