Nos gustaría dar las gracias a Iwan Schie y Sebastián Wachsmann-Hogiu por sus contribuciones en el desarrollo de la técnica del DR-CARS. Semanas Tyler agradece el apoyo del Programa Académico de Lawrence Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser está agradecido por el apoyo de la Asociación Americana del Corazón a través del programa Grant-in-Aid. Este trabajo también fue apoyado en parte por fondos de la Fundación Nacional de Ciencias. El Centro para la Biofotónica, una ciencia NSF y el Centro de Tecnología, está dirigido por la Universidad de California, Davis, en virtud del Acuerdo de Cooperación No. 0120999 PHY. También se reconoce el apoyo del Centro de UCD Clínica Ciencia Traslacional en el número de concesión UL1 RR024146 del Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR).

1. Generación de coches y señales de DR-CARS Con el fin de generar CARS y DR-CARS señales simultáneamente, tres ajustable y sincronizada fuentes láser de pulsos cortos son obligatorios. <ol><li> Para obtener tres pulsos sincronizados de empezar con un solo láser de 10 W (PicoTrain, HighQ láser, Inc.). Este láser tiene una longitud de onda fija de 1064 nm, con una longitud de pulso fijo del 7 ps, y una tasa de repetición fijo de 76 MHz. </li><li> Utilizando una serie de placas de media onda y polarización divisor de haz cubos de la viga se divide en tres partes. Una placa de media onda en combinación con un haz de polarización cubo divisor nos permite ajustar la cantidad de energía en cada componente de la viga sin cambiar su dirección. Normalmente, los dos haces se ajustan a ~ 4,5 W cada uno, y el haz de tercero contiene el resto de 1 W. </li><li> Los dos haces de alta potencia se dirige entonces en dos osciladores independientes óptico paramétrico (OPO es, Avante, APE GmbH, Berlín, Alemania). OPO diferencia de uso de frecuencias para convertir la generación de un fotón de energía más alto en dos fotones de menor energía con diferentes longitudes de onda. Mediante el control de la temperatura del cristal utilizado para lograr este efecto, las longitudes de onda de los fotones resultantes pueden ser controlados de 0,1 nm. Por la frecuencia de duplicación de estas señales, un láser con una longitud de onda de 1064 nm fija ahora se puede transformar en un rayo láser que se pueden sintonizar en cualquier lugar entre 780 nm y 910 nm. Mediante el bombeo de dos por separado OPO con la fuente nm mismo 1064, se obtiene de dos fuentes de láser sintonizables independiente que se sincroniza automáticamente con nuestro láser de bombeo original. </li><li> La tercera (menor potencia) del haz del láser de 1064 nm bomba se dirige todo el de Oporto por una combinación de espejos dicroicos para que los tres haces (2 de la OPO, uno de los láser de bombeo) se pueden recombinar más tarde. Con el fin de producir de manera eficiente coherente fotones de la señal Raman los pulsos recombinados deben ser superpuestas, tanto temporal como espacialmente. Porque OPO contienen cavidades anillo, permitiendo que cada pulso de láser para pasar a través de los tiempos múltiples de cristal, los rayos enviados a través de los viajes del OPO es una distancia adicional que resulta en un retraso considerable en relación con el haz de bombeo original. Esta distancia debe ser compensada con el haz de tercero mediante la introducción de espejos adicionales que obligan a este rayo en recorrer la misma distancia que los otros dos antes de que se vuelven a combinar el uso de espejos dicroicos. </li><li> A fin de proporcionar un ajuste fino de la longitud de la trayectoria de cada rayo viaja etapas de retardo ajustable, con retrorreflectores prisma, se introducen en cada paso del haz. </li><li> Otro conjunto de placas de media onda y polarización cubos divisor de haz se añaden a cada haz que nos permite ajustar la potencia de cada haz de forma independiente sin afectar a la entrada de la de Oporto. </li><li> Espejos dicroicos se utilizan para combinar primero las vigas de la OPO en dos y luego con el haz de onda de 1064 nm. Se debe tener cuidado para asegurar que las vigas son, precisamente, se superponen (es decir, están alineados, y tienen una divergencia similar). Esto se puede comprobar mediante la comparación de la superposición de los haces de cerca (dentro de unos pocos centímetros) y muy lejos de (~ 1 m) del espejo dicroico. </li><li> La ventaja de utilizar los láseres pulsados ​​es que cada pulso puede tener un pico de energía de alta en la muestra, lo que permite la generación eficiente de las señales de Raman coherente, manteniendo una intensidad media baja. Una intensidad media alta puede dañar la muestra. Por lo tanto, con el fin de controlar mejor la intensidad media, sin sacrificar el pico de energía, los tres haces combinados se envían a través de un modulador electro-óptico (células Pockel, el ConOptics) que funciona como un selector de pulso, que nos permite ajustar la tasa de repetición de los pulsos que llegar a la muestra y por lo tanto, la intensidad media. </li><li> Los rayos láser se combinan entonces junto a un microscopio invertido con un objetivo de alto NA. El objetivo es normalmente un 60 X agua lente del objetivo con una apertura numérica (NA) de 1.2 que se ha corregido la aberración cromática en toda la gama de ajustabilidad de los nuestros OPO y el haz de onda de 1064 nm. El estrecho enfoque generado por la lente del objetivo de alto NA permite la generación más eficiente de las señales de Raman coherente en la escala del micrón. </li><li> Los haces se combinan ampliado con el fin de llenar en exceso la parte de atrás-puerto del objetivo del microscopio. Por sobrecargar la parte de atrás de el objetivo del microscopio podemos lograr las mejores condiciones de enfoque y por lo tanto, la mejor resolución espacial en nuestro sistema de microscopio. </li><li> La lente del objetivo de nuestro microscopio se monta en un escenario XYZ piezo que nos permite obtener imágenes de mapa de bits de detección de los rayos a través de la muestra, similar a la exploración comercial de haz microscopios confocal. </li></ol> 2. El uso de tres láseres pulsados ​​corto El uso de los tres resultados a corto pulso láser en la producción de señales de varios coches, de los diferentes combinations de dos rayos láser, así como los coches de 3 colores y el DR-FWM señales de la combinación de los tres rayos láser. <ol><li> Las longitudes de onda de las señales puede mentir espectralmente cerca uno del otro. Cuando las señales están muy juntas, puede ser difícil de separar para el análisis utilizando filtros de banda de longitudes de onda fija y espejos dicroicos. Por esta razón, nuestras señales se pasan a un espectrómetro de imágenes (SpectraPro 2300i, Acton Research), que también sirve como un monocromador eficiente para separar espacialmente las señales a diferentes longitudes de onda. </li><li> Un espejo accionado electrónicamente tirón en el espectrómetro, en la posición baja envía la señal a un retroiluminado profundo agotamiento del dispositivo de carga acoplada (CCD) que proporciona información espectroscópica en todo el rango de la señal completa y nos permite identificar y optimizar los diversos coherente señales Raman. </li><li> Para seleccionar la señal con la que queremos que la imagen basta con girar la rejilla en el espectrómetro, con el que ofrece el proveedor de software de control y adquisición de datos (WinSpec, Princeton Instruments), al centro del pico de interés de la cámara CCD y luego cambiar el posición del espejo del tirón a redirigir la señal a un puerto de segunda salida a la que ha sido una avalancha de conteo de fotones simples fotodiodo (APD) adjunto. </li><li> La lente del objetivo es entonces raster escaneados y las señales registradas en la APD se utilizan para generar una imagen que muestra el conteo de fotones de cambio para cada píxel a través del software de adquisición de datos (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlín, Alemania). </li><li> Repetimos este procedimiento para cada imagen deseada de la señal Raman coherente que nos permite comparar las señales durante el post-procesamiento. </li></ol> 3. Preparación de la muestra Con el fin de obtener imágenes claras y reproducibles algunos se debe tener cuidado en la preparación de la muestra. <ol><li> Las muestras se preparan típicamente en ~ 150 micras de espesor cubreobjetos de vidrio. Estas laminillas son lo suficientemente delgada como para permitir obtener imágenes de alta resolución con el 1,2 NA objetivos que se utilizan normalmente. </li><li> Captura óptica de los objetos dieléctricos puede ocurrir cuando la luz del láser se difracta a través de pequeños objetos transparentes. El uso de una fuerte orientación, la potencia pico alto, corto rayos láser pulsado continuación, puede arrastrar pequeñas células o bacterias a lo largo, lo que resulta en imágenes borrosas o manchadas. A fin de evitar esto, puede ser necesario inmovilizar la muestra sobre la superficie del cubreobjetos aplicando primero una capa fina de poli-L-lisina por spin-coating. </li><li> De las células en cultivo de vidrio placas de cultivo inferior se puede utilizar que permiten obtener imágenes sin la necesidad de separar las células de sus platos de crecimiento de cultivos celulares. </li><li> Para la demostración de esta contribución en primer lugar un depósito C. formaldehído-fijo elegans gusano nematodo en una hoja de cubierta de vidrio. </li><li> A continuación, agregue una gota de 20 l de solución de glucosa al 5 M deuterado con el gusano. La solución de glucosa deuterado proporciona una firma Raman experiencia única y fuerte. </li></ol> 4. Análisis de muestras Con el fin de aprovechar adecuadamente el efecto de mejora doblemente resonante de los espectros Raman de ambas sustancias Raman resonante debe ser conocido. <ol><li> Una vez que la muestra se prepara en el cubreobjetos se analiza con un microscopio confocal de Raman para obtener el correspondiente espectro Raman espontánea e identificar picos adecuados. </li><li> Para llevar a cabo DR-CARS se identifican los lugares espectral de la modo de estiramiento CH, por lo general asociados con lípidos, y el modo de CD tramo, asociado a la glucosa deuterado, a 2845 cm -1 y 2121 cm-1, respectivamente. </li><li> Dispersión Raman coherente se logra cuando la diferencia de frecuencia entre dos rayos láser coincide con la frecuencia de una vibración molecular. Al sintonizar una OPO a 817 nm se estudiará el modo de 2.845 cm -1 CH cuando se combina con el rayo láser de 1064 nm y mediante la regulación del OPO otros a 868 nm se probará el 2121 cm -1 pico cuando se combina con el haz de onda de 1064 nm . </li><li> Por trama de barrido de la muestra en el microscopio CARS, ahora podemos observar tres señales coherentes Raman de interés. A COCHES señal de sondeo de la CH vibración de alargamiento, una señal de sondeo CARS el modo tramo CD, y una señal de DR-CARS sondeo ambos. </li><li> Seleccionamos cada pico como se describe en la Sección 2.3 y tomar una imagen como se describe anteriormente. </li></ol> 5. Procesamiento de imágenes Extraer información adicional sobre la base de estas tres imágenes ahora requiere un poco de procesamiento de imágenes bastante simple. <ol><li> En primer lugar las imágenes deben ser normalizados. En la teoría de la normalización se puede lograr por cuenta de la intensidad de cada láser que intervienen en cada proceso de generación de la señal. En la práctica, sin embargo, esto no siempre funciona, sobre todo debido a la respuesta espectral no uniformede espejos dicroicos, detectores, y rejas. </li><li> Un método práctico para la normalización se basa en el hecho de que en las regiones donde los lípidos puros dominan la señal, la resonancia de CD no debe contribuir a cualquiera de las señales. Del mismo modo, en las regiones de solución de glucosa pura la resonancia CH no deben contribuir a cualquiera de las señales. Con esto en mente, se normaliza la imagen DR-CARS y la imagen CARS obtenidos en la resonancia CD de la solución de glucosa deuterado a una región y fuera de la C. elegans gusano que no presentarán la resonancia CH. </li><li> Entonces identificar una región en el gusano en la imagen de resonancia CH-CARS que es rica en lípidos y normalizar a la región correspondiente dentro de la normalización DR-CARS imagen. Para que este método funcione correctamente se supone que en lo profundo de esta región no deuterado glucosa está presente. Esto es una suposición segura puesto que los lípidos son hidrófobos y no se mezcla con la solución. </li><li> Ahora, restando la normalización CH-resonante de la imagen CARS normalizado DR-CARS imagen que nos queda sólo la amplificación de la señal de CD-resonante. </li><li> Del mismo modo, restando la normalización CD-resonante de la imagen CARS normalizado DR-FWM la imagen que nos queda sólo el CH-resonancia amplifica la señal. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Esquema del sistema de microscopía CARS DR-como se describió anteriormente. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: imagen de luz blanca de una C. gusano elegans en una solución de glucosa deuterado preparada en un cubreobjetos y listo para su imagen. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3:. Espectro Raman de ácido oleico modificados (un ácido graso insaturado) que incluye una modificación alquino (un triple enlace carbono carbono del grupo) Las resonancias CH fuerte en 2845 cm -1 y la resonancia alquino a 2100 cm-1 son bien aislada de la región de huellas digitales (la región de gran densidad de picos para llevar), lo que los marcadores ideal para imágenes Raman coherente. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4:. Típico espectro de Raman coherente las señales generadas cuando tres rayos láser de pulso corto se superponen en la muestra Las flechas indican el proceso (s) responsables de cada señal, representado por diagramas de energía. En los diagramas que se muestran aquí las flechas discontinuas indican los fotones del láser y la de Oporto y las flechas continuas indican la señal resultante. Las líneas horizontales sólidas indican la energía de las vibraciones Raman y dar una representación visual que, en el DR-CARS, mezcla de los mismos 3 fotones de entrada de forma simultánea dos sondas diferentes vibraciones Raman. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Los resultados típicos de la imagen C. elegans gusanos utilizando DR-CARS y los coches. La fila superior utilizan las tres señales se indica en la Figura 4 a la imagen de un gusano en una solución de glucosa deuterado. En la segunda fila las imágenes se normalizaron de manera adecuada y en la tercera fila las imágenes fueron producidas por diferencia restando cada una de las imágenes de los coches de la imagen DR-CARS.

<ol>
	<li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li><li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+(CARS).">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li><li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions.">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li><li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+(DR-FWM).">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li><li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting.">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li></ol>

Espectroscopia Raman y las imágenes Raman basado son poderosas herramientas emergentes de las ciencias bio. En la actualidad, esto es particularmente cierto para los in vivo e in vitro en el estudio del metabolismo celular y trastornos metabólicos en el procesamiento y almacenamiento de los lípidos. La mayoría de bio-macromoléculas contienen un gran número de similares, en su mayoría a base de carbón enlaces moleculares, por lo que los espectros Raman obtenidos a partir de las células y los organismos son generalmente una convolución de las contribuciones de los lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, azúcares, lípidos, etc son relativamente fáciles de para aislar a partir de estos espectros complejos, debido a su tendencia a formar gotas densas o bicapas y debido a que contienen largas cadenas con un gran número de enlaces CH alifáticos. Nuestra capacidad de aislar las proteínas específicas, aminoácidos, ARN o ADN dentro del entorno celular compleja, sin embargo, muy limitada. Esto es particularmente cierto si estas moléculas de interés sólo están presentes en concentraciones M y por debajo. En este caso, la capacidad de conseguir débiles resonancias Raman utilizando nuestro recién introducido DR-CARS diferencia técnica de imagen ofrece un enfoque poderoso para su microanálisis químico y de imagen. Es cierto que la parte más complicada de este protocolo es la alineación y sincronización del sistema láser. Cuando se inicia a partir de cero, la sincronización de los pulsos, es decir, garantizar que los pulsos se superponen en el tiempo a pesar de los diferentes caminos que toman pueden ser facilitadas por el uso de un autocorrelador pulso. Superposición espacial y temporal, una vez se logra, los coches y el DR-CARS señales deben ser fácilmente detectable. Sin embargo, la primera alineación es a menudo crudo, lo que resulta en señales débiles. La mejor práctica para la alineación de este sistema así es la generación de señales débiles al principio y luego para mejorar la potencia de la señal suavemente ajustar los espejos a lo largo de cada ruta y el ajuste de la coincidencia temporal con la fase de retardo. A pesar de los actos del espectrómetro / monocromador como deflector muy eficiente para la luz ambiente más limpio se pueden lograr resultados de operación del sistema con las luces del cuarto apagada y las cortinas o los tubos de lentes para minimizar el fondo presentado por las fuentes de luz varios otros (por ejemplo, los monitores de ordenador, indicadores luminosos, LED, etc.) Nuestra configuración particular utiliza un solo fotón contando avalancha de fotodiodos (APD) y detectores de tiempo correlacionada conteo de fotones simples (TCSPC) para la detección de hardware 5. Esto nos permite detectar señales muy débiles de ruido relativamente bajo, pero muchos grupos se han encontrado tubos fotomultiplicadores (PMT), con ganancia variable ventaja al tomar medidas similares. La ventaja de la PMT es que ofrecen ganancia variable y tienen un área de detección mucho más grande que se puede simplificar el alineamiento del detector. Además, nuestra configuración utiliza las etapas piezoeléctrico para traducir el objetivo con el fin de lograr la exploración del haz. La ventaja de esto es que tenemos la posibilidad de regresar a cualquier punto dentro de la imagen escaneada con anterioridad con un alto grado de precisión y tomar medidas adicionales, como espectros Raman espontánea. Otros grupos han tenido éxito utilizando análisis conjuntos de espejo, o las unidades de exploración confocal incluso todo, como el sistema Olympus FluoView, que ofrece una imagen mucho más rápido, pero es limitado en su capacidad de volver precisamente a ubicaciones arbitrarias dentro de una imagen. Puesta a punto del láser para que coincida con la resonancia Raman es también un paso crítico que puede ser necesaria una optimización. A pesar de los picos Raman se puede conocer la intensidad máxima de pico espectral obtenida de DR-CARS y los coches no se corresponde necesariamente con el máximo del pico Raman espontánea. Esto se debe a la interferencia intrínseca de las señales generadas por la mezcla de cuatro ondas dando lugar a una señal de fondo no resonante y automóviles, lo que distorsiona los espectros de CARS en relación con los espectros Raman espontánea. La ubicación del espectro del pico de la señal de los coches se pueden calcular, pero un enfoque más práctico es sintonizar el OPO en varias etapas, a través de pequeñas espectral de la ubicación prevista de la resonancia Raman. Este proceso debería producir un máximo claro. De hecho, para la mayor sensibilidad del DR-FWM resonancias tanto deben estar sintonizados a este máximo. Un último problema potencial del enfoque DR-CARS también tiene que ser discutido, es decir, la señal de DR-CARS dependerá de una distribución homogénea de la molécula de amplificación Raman-activa. Para la mayoría de los objetos biológicos, esto bien podría ser la amplia resonancia OH del agua, que es abundante y omnipresente casi. El agua es, sin embargo, excluidas de las regiones hidrofóbicas con una célula, como las gotas de lípidos, lo que lleva una distorsión de las señales obtenidas cuando se utiliza la resonancia de agua para ampliar los modos de lípidos. En nuestro ejemplo, hemos utilizado una solución de glucosa deuterado para generar una señal fácilmente detectables y abundante de la muestra biológica. Del mismo modo, deuterado agua o deuterado buffe biológicars, como d-HEPES se podrían utilizar. En nuestro ejemplo, las gotas de lípidos en el C. gusano elegans fueron lo suficientemente pequeño como para contener siempre tanto, la solución de glucosa y lípidos deuterado en el punto del láser centrado de nuestro sistema. Sin embargo, esto no es cierto en general. Un ejemplo concreto sería adipocitos, que generan las gotas de lípidos más grandes dentro de su citoplasma. Esto significa, cualquier experimento realizado con la técnica del DR-CARS requiere una cuidadosa preparación y control de los experimentos para comprobar los resultados.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60X water immersion objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>UPLSAPO 60XW</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>IX-71SIF-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ConOptics</td>
<td>350-160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picotrain pump Laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HighQ</td>
<td>IC-1064-10000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optical Parametric Oscillator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>APE</td>
<td>Levante IR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-102 25cm-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Half-wave plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>AHWP05M-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polarizing Beam Splitter Cubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>PBS052 or PBS053</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrometer/Monochromator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>Spectra Pro 2300i</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>PIXIS: 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Avalanche Photo Diode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>SPCM-AGR-14-12691</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYZ Piezo Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Physik Instruments</td>
<td>P 733-2CL P 721.CDQ</td>
<td>This is a combination of an XY stage and a Z objective holder</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirrors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td>
<td>These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>Z830rdc</td>
<td>To combine the different near-infrared laser beams</td>
</tr>
<tr>
<td>TCSPC board</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>Timeharp 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Symphotime Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

differential imaging of biological structures with doubly-resonant coherent anti-stokes raman scattering (cars)

Coherente las técnicas de imagen Raman han visto un aumento dramático en la actividad durante la última década debido a su promesa de permitir sin etiquetas de imagen óptica con alta especificidad molecular 1. La sensibilidad de estas técnicas, sin embargo, es muchos órdenes de magnitud más débil que la fluorescencia, lo que requiere mili molar 1,2 concentraciones moleculares. Aquí se describe una técnica que puede permitir la detección de concentraciones débiles o de baja de Raman-activa las moléculas mediante la amplificación de su señal con la obtenida de dispersores Raman fuertes o abundantes. La interacción de corto láseres pulsados ​​en una muestra biológica genera una variedad de señales coherentes dispersión Raman, cada uno de los cuales llevan la información química única de la muestra. Normalmente, sólo una de estas señales, por ejemplo coherente de lucha contra la dispersión Raman Stokes (CARS), se utiliza para generar una imagen, mientras que los demás se descartan. Sin embargo, cuando estas señales, incluyendo CARS 3-color y mezcla de cuatro ondas (FWM), se recogen y se compara con la señal CARS, de lo contrario difícil de detectar información se puede extraer 3. Por ejemplo, los automóviles doblemente resonante (DR-CARS) es el resultado de la interferencia constructiva entre dos señales de resonancia 4. Demostramos cómo ajuste de los tres rayos láser para producir DR-CARS señales a los 2845 cm -1 vibración tramo CH en los lípidos y los 2120 cm -1 CD vibraciones de estiramiento de una molécula de deuterio (por ejemplo, azúcares deuterado, ácidos grasos, etc) pueden ser utilizados para investigar tanto las resonancias Raman al mismo tiempo. En estas condiciones, además de las señales de los coches de cada uno de resonancia, una combinación de DR-CARS señal de sondeo tanto también se genera. Demostramos cómo detectar la diferencia entre la señal de DR-CARS y amplificar la señal de vibración de una molécula abundante se puede utilizar para aumentar la sensibilidad de la señal más débil. Además, demuestran que este enfoque se extiende incluso a aplicaciones en las que ambas señales son generadas a partir de moléculas diferentes, de tal manera que por ejemplo, con la fuerte señal Raman de un disolvente se puede mejorar la señal débil Raman de un soluto diluido.

Watch this Scientific Journal Video about Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS at JoVE.com

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Una combinación de tres única longitud de onda de pulso corto láser se utiliza para generar coherente de lucha contra la dispersión Raman Stokes (CARS) y el CARS doblemente resonante (DR-CARS). La diferencia entre estas señales proporciona una mayor sensibilidad de otro modo difíciles de detectar señales de Raman coherente, lo que permite imágenes de la debilidad de dispersores Raman.

Diferencial de imágenes de las estructuras biológicas con doblemente resonante coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

differential-imaging-biological-structures-with-doubly-resonant

Research

JoVE Journal

Biology

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

13.6K vistas.  University of California, Davis. Una combinación de tres única longitud de onda de pulso corto láser se utiliza para generar coherente de lucha contra la dispersión Raman Stokes (CARS) y el CARS doblemente resonante (DR-CARS). La diferencia entre estas señales proporciona una mayor sensibilidad de otro modo difíciles de detectar señales de Raman coherente, lo que permite imágenes de la debilidad de dispersores Raman.

Video: Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de fase y de interferencia diferencial microscopía de contraste (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Investigación

Biología

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en sistemas biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging membrana plasmática Deformaciones Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Implementación de un sistema coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) en un Ti: Zafiro y OPO láser basado en Laser Standard Microscopio de Barrido

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo de amarillo fluorescente proteína Tagged p62 en estructuras Aggresome inducida por

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Super-Resolución De Imágenes De Células Vivas De Estructuras Subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron spin echo, diffraction, and inelastic scattering. Unlike neutron scattering techniques that obtain information in reciprocal space, attenuation-based neutron imaging measures a signal in real space that is resolved on the order of tens of micrometers. The principle of neutron imaging follows the Beer-Lambert law and is based on the measurement of the bulk neutron attenuation through a sample. Greater attenuation is exhibited by some light elements (most notably, hydrogen), which are major components of biological samples. Contrast agents such as deuterium, gadolinium, or lithium compounds can be used to enhance contrast in a similar fashion as it is done in medical imaging, including techniques such as optical imaging, magnetic resonance imaging, X-ray, and positron emission tomography. For biological systems, neutron radiography and computed tomography have increasingly been used to investigate the complexity of the underground plant root network, its interaction with soils, and the dynamics of water flux in situ. Moreover, efforts to understand contrast details in animal samples, such as soft tissues and bones, have been explored. This manuscript focuses on the advances in neutron bioimaging such as sample preparation, instrumentation, data acquisition strategy, and data analysis using the High Flux Isotope Reactor CG-1D neutron imaging beamline. The aforementioned capabilities will be illustrated using a selection of examples in plant physiology&#160;(herbaceous plant/root/soil system)&#160;and biomedical applications&#160;(rat femur and mouse lung).

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory&#039;s High Flux Isotope Reactor

This manuscript describes a protocol for neutron radiography and computed tomography of biological samples using a High Flux Isotope Reactor (HFIR) CG-1D beamline to measure a metal implant in a rat femur, a mouse lung, and an herbaceous plant root/soil system.

Radiografía de neutrones y tomografía computarizada de sistemas biológicos en el reactor de isótopos de alto flujo del Laboratorio Nacional de Oak Ridge

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron ...