La microscopía de dispersión Raman estimulada es una tecnología de imágenes químicas que permite la detección rápida y cuantitativa de lípidos y permite el seguimiento de lípidos en animales vivos de una manera libre de etiquetas. La ventaja más importante de la microscopía SRS sobre las técnicas tradicionales de detección de lípidos es que está libre de etiquetas y, por lo tanto, no es tan sostenible para el fotoblanqueamiento como otras cuestiones de fluorescencia y tinción. El uso de la microscopia srs en conjunción con las herramientas genéticas y bioquímicas disponibles para los organismos modelo, en particular Caenorhabditis elegans proporciona un marco de gran alcance para el estudio de los reguladores normales de la biología de lípidos y el metabolismo.
Para introducir rayos láser en el microscopio SRS, primero, configure el periscopio para que levante el haz desde una salida de fuente de luz de picosegundos hasta el puerto de entrada de láser infrarrojo en el escáner del microscopio y abra el software de control láser para iniciar los láseres. Baje la potencia del láser de la bomba a 50 milivatios y establezca la señal de la bomba en 750 nanómetros. Utilice un expansor de haz para ajustar el diámetro del haz para que se ajuste a la apertura posterior de los objetivos del microscopio.
Utilice dos espejos de relé, M1 y M2, para guiar el rayo láser al periscopio y establezca los guiños del periscopio en el centro del rango de ajuste. Seleccione la posición inicial y el ángulo de cada espejo de tal manera que el rayo láser golpee aproximadamente el centro del espejo para lanzar el haz al microscopio y utilice un puerto vacío en la torreta objetivo del microscopio para realizar la alineación del curso. Coloque la sonda del medidor de potencia en el puerto objetivo para medir la potencia de la luz transmitida y configure el escáner del microscopio en el zoom más alto, 50X.
Mida la potencia de la luz transmitida con el punto de rayo láser enfocado y optimice las perillas de los espejos M1 y M2 de forma iterativa para lograr la mayor potencia láser transmitida. Utilice la herramienta de alineación para realizar la alineación fina de la luz transmitida para asegurarse de que la luz está pasando por el centro del objetivo y coloque la tapa de alineación del objetivo de fluorescencia en el asiento objetivo vacío. Ajuste las perillas del primer espejo de dirección, M1, para centrar el punto del rayo láser e introduzca el tubo de extensión con la tapa de alineación en el otro extremo a un asiento objetivo vacío para monitorear el punto del rayo láser.
Luego, afina las perillas del segundo espejo de dirección, M2, para centrar el punto del rayo láser nuevamente en el otro extremo del tubo de extensión. Para configurar el módulo de detección srs, coloque un cubo divisor de haz después del condensador para dirigir el láser transmitido al módulo de foto diodo. Para configurar la conexión electrónica, utilice un modulador electroóptico incorporado a 20 megahercios dentro del láser sintonizado de picosegundos para modular la intensidad del haz de Stokes y alimentar la señal de salida del foto diodo en el amplificador de bloqueo para la demodulación de la pérdida raman estimulada.
Luego, alimente la salida del amplificador de bloqueo en la caja analógica del microscopio para convertir la señal analógica eléctrica en una señal digital. Para optimizar las condiciones de obtención de imágenes, agregue cinco microlitros de ácido oleico a una cámara de portaobjetos de mini microscopio y cubra la muestra con un resbalón de cubierta. Coloque la muestra en la etapa del microscopio y use el borde de la almohadilla para localizar y enfocar la gota.
Ajuste el condensador para la iluminación Kohler y utilice una tarjeta de sensor infrarrojo y un visor de infrarrojos para comprobar si la trayectoria del haz de la bomba sigue siendo correcta. Confirme que la etapa de retardo se establece en cero femtosegundos y establezca la longitud de onda del haz de la bomba en 795,8 nanómetros. Establezca la potencia del haz de la bomba en 50 milivatios y establezca el haz de Stoke en 100 milivatios.
Abra el obturador tanto para los haces, así como el obturador principal del láser. Escanee la muestra y compruebe la imagen en la pantalla del ordenador. Cambie el modo de visualización a alto bajo y ajuste el rango para ver una saturación de aproximadamente 50%.
Compruebe si la saturación está centrada en la imagen, ajustando cuidadosamente los espejos de dirección dentro del sistema láser sintonizado de picosegundos para optimizar la superposición de la bomba y el Stokes para maximizar la intensidad de la imagen y centrar la intensidad máxima según sea necesario. Antes de cada sesión de imágenes, agregue 100 microlitros de agarosa caliente al 2% a un portaobjetos de vidrio limpio colocado entre los portaobjetos de soporte con dos capas de cinta de laboratorio y coloque rápidamente un segundo portaobjetos en la parte superior del primer portaobjetos. Se presiona suavemente para crear una almohadilla de agarosa delgada, uniforme, y permitir que la agarosa se enfríe.
Para montar los gusanos para la proyección de imagen, coloque una gota del cuatro a cinco microlitro del agente anestésico por cada 10 a 20 gusanos sobre un resbalón de la cubierta y utilice un microscopio de la disección para recoger los gusanos que se fotodearán, colocando los gusanos en la gotita de la anestesia mientras que se recogen. Cuando se hayan recogido todos los gusanos, cubra los gusanos con el portaobjetos de vidrio con la almohadilla de agarosa. Para obtener imágenes, monte la muestra de gusano con el resbalón de la cubierta frente a la lente objetivo y dirija la fuente de luz de campo brillante al ocular para localizar los gusanos.
Enfoque los gusanos y ajuste la posición del condensador en consecuencia. Ajuste las potencias del láser ajustando la potencia del láser de la bomba a 200 milivatios y la potencia ir a 400 milivatios. Configure el amplificador de bloqueo para la demodulación de la señal SRS del gusano.
Comience a escanear el primer gusano a una velocidad de escaneo rápida, ajustando el enfoque fino para encontrar el área de interés. Cuando la señal se haya optimizado, cambie a una velocidad de escaneo más lenta y una resolución de píxeles más alta para obtener la imagen SRS y guardar la imagen en un formato que permita una alta resolución. Cuando se hayan obtenido imágenes de todas las muestras, coloque la fuente láser en espera y apague todo el equipo asociado.
Para analizar las imágenes, abra los archivos en ImageJ y seleccione analizar y establecer medidas para seleccionar las propiedades que se van a analizar. Utilice la herramienta de selección de polígonos para delinear la región del intestino del gusano que se va a cuantificar y haga clic en analizar y medir de nuevo. Las mediciones aparecerán en la ventana de resultados.
Cuando se hayan descrito todos los gusanos, copie y pegue las mediciones de cada uno de los gusanos de un genotipo determinado en una hoja de cálculo. Para el valor de medición de fondo, seleccione un área en las proximidades del gusano que no tenga ninguna señal SRS y reste el valor de gris medio de fondo de la medición para cada gusano individual para calcular el promedio y la desviación estándar de los valores de gris medio restados de fondo de todos los gusanos en un genotipo o grupo de prueba dado. Estos valores se pueden normalizar al promedio del grupo de control.
En este análisis representativo, los niveles de lípidos intestinales en el tipo salvaje edad-sincronizado gusanos y los mutantes daf-2 que carecían del receptor de la insulina fueron cuantificados durante edad adulta. Como era de esperar, se observa una disminución en los niveles de lípidos en gusanos de tipo salvaje, comenzando en el primer día y continuando hasta el noveno día de la edad adulta. Los niveles de lípidos en los mutantes daf-2, sin embargo, aumentan hasta que tienen cinco días de edad, momento en el que permanecen constantes en aproximadamente 2,5 a tres veces más alto que el tipo salvaje.
La inactivación de Daf-16 suprime el aumento de los niveles de lípidos de los mutantes daf-2. La expresión de la isoforma daf-16a a o daf-16b en la daf-2, daf-16 mutantes dobles no restaura los niveles de lípidos. La expresión de la isoforma daf-16d/f/h, sin embargo, es suficiente para restaurar los niveles de lípidos en daf-2, daf-16 mutantes dobles a los niveles observados en daf-2 mutantes individuales.
Estos resultados indican que la isoforma daf-16d/f/h modula específicamente el metabolismo lipídico en gusanos mutantes daf-2. Es importante utilizar la misma potencia láser para la bomba y los haces de Stokes a lo largo de la sesión de imágenes e incluir un grupo de control en cada seis y cuatro cuantificaciones consistentes. Además de cuantificar el almacenamiento de lípidos, la microscopía SRS puede acoplarse con etiquetas bioorthogonales, como el deuterio, e implementarse para visualizar la dinámica de incorporación, síntesis y degradación de lípidos.
La microscopia SRS permite la multiplexación y se puede implementar para obtener imágenes de múltiples biomoléculas en diferentes compartimentos subcelulares. La llamada microscopía hiperespectral SRS tiene un gran futuro en la exploración de la dinámica metabólica.
