En este video describimos un conjunto de procedimientos diseñados para interrogar el impacto de una infección viral y la respuesta inmunológica resultante utilizando un modelo Murine de infección por Zika. Este protocolo es significativo porque nos permite desarrollar una comprensión mecanicista de la infección y la inmunidad identificando hasta qué punto un virus se ha diseminado por todo el cuerpo, transversando barreras físicas y accediendo a los tejidos. Estas técnicas permiten una comprensión detallada de la patogénesis viral y proporcionan la capacidad de diseccionar el mecanismo de protección proporcionado por las vacunas o terapias.
Aquí demostramos este método utilizando la infección por el virus del Zika de ratones, pero este método se puede aplicar a una serie de infecciones virales, incluyendo otros flavivirus como el virus del Dengue y alfavirus como el virus Chikungunya. Cosechar los órganos del sistema nervioso central puede ser un desafío, por lo que es importante que una persona planee un pequeño experimento y esté preparada para practicar las técnicas de antemano. Este protocolo permite la rápida disección de la propagación viral dentro de modelos animales pequeños con la capacidad de visualizar, capturar y almacenar datos experimentales.
Es importante demostrar visualmente este método para permitir que el experimentador entienda cómo cosechar los órganos del sistema nervioso central. También es importante ver el nivel de confluencia celular y la intensidad de los focos virales. Para comenzar, utilice fórceps para eliminar la piel del ratón infectado.
Decapitar la cabeza del ratón con tijeras, seguido de la eliminación de los brazos y las piernas. Para cosechar el cerebro, usa tijeras la Grange serradas para cortar el cráneo a través del foramen magnum. Pelar el cráneo con fórceps, y sacar el cerebro con una espátula.
Usando tijeras contundentes fuertes, retire el hueso que rodea la columna vertebral, luego corte a través del hueso pélvico para exponer el foramen vertebral a nivel lumbar. Luego, retire tanto músculo como sea posible que rodea la columna vertebral. Coloque cuidadosamente la punta biselada de la aguja dentro del foramen vertebral, evitando la presión excesiva para evitar que la aguja invada el cuerpo vertebral.
Sostenga fuertemente para ejercer presión sobre el cuerpo vertebral y la aguja, y presione el émbolo de la jeringa para expulsar el cable en la placa de petri. Transfiera inmediatamente la médula espinal en el tubo etiquetado y colóquela en el baño de hielo seco para una mayor homogeneización. Para la homogeneización, agregue un mililitro de DMEM y homogeneice la muestra en un BeadBeater.
Después de asegurar que los órganos son homogeneizados, centrífugas y muestras de alícuotas en hielo y almacenar en el menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario. El día del ensayo, retire las muestras homogeneizadas del congelador de menos 80 grados centígrados y permita que se descongelen. Con las muestras sobre hielo, diluir el virus del Zika diez veces en el primer pozo de la placa de dilución y utilizar una pipeta multicanal para hacer diez veces diluciones seriales por la placa, cambiando las puntas cada vez.
Al añadir 20 microlitros de muestra en 180 microlitros de medios de crecimiento, cambie las puntas de pipeta entre cada dilución. Prepare la placa de formación de enfoque quitando el medio de la placa plana preparada de 96 pozos que cubre las virocélulas. Para evitar que la monocapa se seque, añada inmediatamente 100 microlitros de la dilución del virus a cada pocótulo de la viropla.
Utilice el mismo conjunto de consejos para añadir de la concentración más baja a la más alta. Placa de roca de lado a lado de dos a cuatro veces e incubar a 37 grados Celsius en 5% dióxido de carbono durante una a dos horas. Calentar 2%metilcelulosa a temperatura ambiente.
A continuación, diluir la solución de 2%metilcelulosa en medios de crecimiento en una proporción de aproximadamente dos a uno. Después de la incubación, añadir 125 microlitros de los medios de crecimiento de metilcelulosa a cada pocillo de las placas de 96 pocillos. Incubar de nuevo a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono durante 32 a 40 horas.
Para fijar las virocélulas, en un gabinete de bioseguridad añadir 50 microlitros de 5%paraformaldehído sobre la parte superior de la capa de metilcelulosa en cada pozo de las placas de 96 pozos. Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Alternativamente, cubra las placas con Parafilm y colóquelas a cuatro grados centígrados durante la noche.
Después de eso, utilice una pipeta para eliminar la superposición y los medios de las células en un recipiente desechable dentro del gabinete de bioseguridad. Lavar suavemente con 150 microlitros de PBS por pozo. Retire el PBS de las placas y retire la placa del gabinete de bioseguridad.
Repita el lavado PBS dos veces, luego agregue 150 microlitros por pozo una vez FFA tampón de lavado y deje a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos para permeabilizar las células fijas. A continuación, utilice el anticuerpo primario de Zika para detectar la infección. Preparar el anticuerpo primario 4G2 a una concentración de un microgramo por mililitro en tampón de tinción FFA.
Flick FFA tampón de lavado de las placas, y añadir 50 microlitros del anticuerpo primario en el tampón de tinción FFA a cada pozo. Luego sella las placas con Parafilm, o película de plástico, e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Prepare el anticuerpo antiratón HRP secundario con una concentración de uno a 5.000 en el tampón de tinción FFA.
Después de retirar la solución de anticuerpos, lave las células tres veces con 150 microlitros FFA tampón de lavado por pozo. Retire el tampón de lavado moviendo el fregadero cada vez. Manche las células con el anticuerpo secundario en el tampón de tinción FFA a 50 microlitros por pozo e incubar de una a dos horas a temperatura ambiente.
Después de eso, lave las células tres veces con el tampón de lavado FFA, de nuevo, quitando el tampón de lavado moviendo el fregadero cada vez. Agregue 50 microlitros del sustrato TrueBlue a cada pozo. Espere de dos a 15 minutos hasta que las manchas estén completamente definidas con un fondo mínimo.
Después de que las manchas sean visibles, lave suavemente con agua con una mano para proteger a la monocapa de la fuerza del agua que corre. Toque seco en toallas de papel. Poco después, utilice un ámbito de disección para contar manualmente los puntos de cada pozo o utilice un contador de puntos automatizado.
En el software ImmunoCapture, seleccione una dilución con focos fácilmente distinguidos entre 20 y 200 por pozo para cada muestra y calcule el título en unidades formadoras de enfoque por milímetro utilizando el promedio de pozos duplicados. En este experimento, se mostró una carga viral en los tejidos periféricos y del sistema nervioso central después de que los ratones Ifnar recibieran el virus del Zika por vía subcutánea. El límite de detección era de entre 100 y 500 FFU por gramo, basado en el órgano.
Al realizar el ensayo de formación de enfoque, los errores técnicos pueden dar lugar a resultados subóptimos. La toxicidad de los órganos, impulsada por una alta concentración de hígado, alteró la sensibilidad del ensayo. Cuando el título viral en el órgano era menor que la toxicidad, el FFA no podía registrar con precisión los títulos virales.
Las células renales ilustraron toxicidad con alta concentración de órganos, pero fueron superadas por el título viral a bajas concentraciones de órganos. El pipeteo o lavado vigoroso puede eliminar la monocapa, lo que provoca la pérdida de datos de informes inexactos de los resultados del título. Las fibras o pelos que están presentes en el papel absorbente de banco de laboratorio, pueden contaminar pozos individuales y causar errores significativos si se utiliza un programa de conteo automatizado.
La densidad celular es otro problema, que puede afectar dramáticamente el éxito de un ensayo de formación de enfoque. Las células a aproximadamente 60% de confluencia al comienzo del ensayo, en comparación con las células chapadas en 90% de confluencia, mostraron una diferencia dramática que impactó el ensayo de formación de enfoque. La planificación del tamaño y el alcance del experimento para que la recolección de órganos se complete de manera eficiente, es la parte más importante del procedimiento, seguido de iniciar el ensayo de formación de enfoque con células de alta calidad.
Este procedimiento se ha utilizado para cuantificar el virus para múltiples familias virales. Este protocolo también se puede adaptar a la mosización de compuestos terapéuticos y cuantificar títulos de anticuerpos neutralizantes. Estas técnicas se utilizan para cuantificar el virus vivo y deben tomarse las medidas de seguridad adecuadas de acuerdo con las directrices establecidas en el BMBL.
