Neste vídeo descrevemos um conjunto de procedimentos projetados para interrogar o impacto de uma infecção viral e a resposta imunológica resultante usando um modelo murino de infecção pelo Zika. Este protocolo é significativo porque nos permite desenvolver uma compreensão mecanicista da infecção e imunidade, identificando até que ponto um vírus se espalhou pelo corpo, transversando barreiras físicas e acessando tecidos. Essas técnicas permitem uma compreensão detalhada da patogênese viral e proporcionam a capacidade de dissecar o mecanismo de proteção fornecido por vacinas ou terapêuticas.
Aqui demonstramos este método usando a infecção pelo vírus Zika em camundongos, mas este método pode ser aplicado a uma série de infecções virais, incluindo outros flavivírus, como o vírus da Dengue e alfavírus como o vírus Chikungunya. Colher os órgãos do sistema nervoso central pode ser um desafio, por isso é importante para uma pessoa planejar um pequeno experimento, e estar preparada para praticar as técnicas de antemão. Este protocolo permite a dissecação rápida da propagação viral dentro de pequenos modelos animais com a capacidade de visualizar, capturar e armazenar dados experimentais.
É importante demonstrar visualmente esse método para permitir que o experimentador entenda como colher os órgãos do sistema nervoso central. Também é importante ver o nível de confluência celular e a intensidade dos focos virais. Para começar, use fórceps para remover a pele do rato infectado.
Decapitar a cabeça do rato com uma tesoura, seguida da remoção dos braços e pernas. Para colher o cérebro, use uma tesoura serrilhada de La Grange para cortar o crânio através do foien magnum. Retire o crânio com fórceps, e retire o cérebro com uma espátula.
Usando uma tesoura forte e sem cortes, remova o osso ao redor da coluna vertebral, depois corte o osso pélvico para expor o forame vertebral ao nível lombar. Em seguida, remova o máximo de músculos possível em torno da coluna vertebral. Cuidadosamente, coloque a ponta chanfrada da agulha dentro do forames vertebral, evitando pressão excessiva para evitar que a agulha invada o corpo vertebral.
Segure fortemente para exercer pressão sobre o corpo vertebral e a agulha, e pressione o êmbolo da seringa para expulsar o cordão para dentro da placa de petri. Transfira imediatamente a medula espinhal no tubo rotulado e coloque no banho de gelo seco para maior homogeneização. Para homogeneização, adicione um mililitro de DMEM e homogeneize a amostra em um BeadBeater.
Depois de garantir que os órgãos sejam homogeneizados, centrífugas e amostras de alíquota no gelo e armazenem menos 80 graus Celsius até que seja necessário. No dia do ensaio, remova as amostras homogeneizadas do congelador menos 80 graus Celsius e deixe-as descongelar. Com as amostras no gelo, dilui o vírus Zika dez vezes no primeiro poço da placa de diluição e use uma pipeta multicanal para fazer diluições seriais dez vezes na placa, mudando as pontas cada vez.
Adicionando 20 microlitadores de amostra em 180 microliters de mídia de crescimento, mude as pontas de pipeta entre cada diluição. Prepare a placa de formação de foco removendo a mídia da placa de 96 poços de fundo preparada cobrindo virocélulas. Para evitar que a monocamado seque, adicione imediatamente 100 microliters da diluição do vírus a cada poço no viroplate.
Use o mesmo conjunto de pontas para adicionar da menor à maior concentração. Placa de rocha lado a lado duas a quatro vezes e incubar a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por uma a duas horas. Aqueça 2% de metilcelulose à temperatura ambiente.
Em seguida, diluir a solução de 2% de metilcelulose em meios de crescimento em uma proporção de aproximadamente dois para um. Após a incubação, adicione 125 microliters da mídia de crescimento de metilcelulose a cada poço das placas de 96 poços. Incubar novamente a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 32 a 40 horas.
Para corrigir as virocélulas, em um armário de biossegurança adicione 50 microliters de 5% paraformaldeído sobre a parte superior da camada de metilcelulose em cada poço das placas de 96 poços. Incubar por 60 minutos em temperatura ambiente. Alternativamente, cubra as placas com Parafilm e coloque-as em quatro graus Celsius durante a noite.
Depois disso, use uma pipeta para remover a sobreposição e a mídia das células em um recipiente descartável dentro do armário de biossegurança. Lave suavemente com 150 microliters de PBS por poço. Remova o PBS das placas e remova a placa do armário de biossegurança.
Repita a lavagem pbs duas vezes, depois adicione 150 microliters por poço uma vez o tampão de lavagem FFA e deixe à temperatura ambiente por cinco a 10 minutos para permeabiliizar as células fixas. Em seguida, use o anticorpo zika primário para detectar infecção. Prepare o anticorpo primário 4G2 a uma concentração de um micrograma por mililitro no tampão de coloração ffa.
Flick FFA lavar tampão das placas, e adicionar 50 microliters do anticorpo primário no tampão de coloração FFA para cada poço. Em seguida, sele as placas com Parafilm, ou filme plástico, e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Prepare o anticorpo cdh de tinta anti-rato secundário com uma concentração de 1 a 5.000 em tampão de coloração DA FFA.
Depois de remover a solução de anticorpos, lave as células três vezes com 150 microliters FFA wash buffer por poço. Remova o tampão de lavagem mexendo na pia cada vez. Manche as células com o anticorpo secundário no tampão de coloração FFA a 50 microliters por poço e incubar de uma a duas horas à temperatura ambiente.
Depois disso, lave as células três vezes com o tampão de lavagem FFA, novamente, removendo o tampão de lavagem, movendo-se para a pia cada vez. Adicione 50 microliters do Substrato TrueBlue em cada poço. Aguarde de dois a 15 minutos até que as manchas estejam totalmente definidas com o mínimo de fundo.
Depois que as manchas estiverem visíveis, lave delicadamente com água usando uma mão para proteger a monocamada da força da água que corre. Bata em toalhas de papel. Pouco depois, use um escopo de dissecação para contar manualmente as manchas em cada poço ou usar um contador de ponto automatizado.
No software ImmunoCapture, selecione uma diluição com focos facilmente distintos entre 20 e 200 por poço para cada amostra e calcule o título em unidades de formação de foco por milímetro usando a média de poços duplicados. Neste experimento, a carga viral foi mostrada nos tecidos do sistema nervoso periférico e central após os camundongos Ifnar receberem o vírus Zika subcutâneamente. O limite de detecção foi entre 100 a 500 FFU por grama, com base no órgão.
Ao realizar o ensaio de formação de foco, erros técnicos podem resultar em resultados subótimos. A toxicidade dos órgãos, impulsionada pela alta concentração hepática, alterou a sensibilidade do ensaio. Quando o título viral no órgão era menor que a toxicidade, a FFA não conseguia registrar com precisão os títulos virais.
As células renais ilustraram a toxicidade com alta concentração de órgãos, mas foram superadas pelo título viral em baixas concentrações de órgãos. Tubulação vigorosa ou lavagem pode remover a monocamadas, levando a relatórios imprecisos de dados perdidos de resultados de titer. Fibras ou cabelos presentes em papel absorvente de banco de laboratório, podem contaminar poços individuais e causar erros significativos se usar um programa de contagem automatizada.
A densidade celular é outra questão, que pode impactar drasticamente o sucesso de um ensaio de formação de foco. As células com aproximadamente 60% de confluência no início do ensaio, em comparação com as células banhadas em 90% de confluência, mostraram diferença dramática impactando o ensaio de formação de foco. Planejar o tamanho e o escopo do experimento para que a colheita de órgãos seja concluída de forma eficiente, é a parte mais importante do procedimento, seguido pelo início do ensaio de formação de foco com células de alta qualidade.
Este procedimento tem sido usado para quantificar o vírus para múltiplas famílias virais. Este protocolo também pode ser adaptado para tela para compostos terapêuticos e quantificar titulações de anticorpos neutralizantes. Essas técnicas são utilizadas para quantificar o vírus vivo e as medidas de segurança apropriadas devem ser tomadas de acordo com as diretrizes estabelecidas no BMBL.
