В этом видео мы описываем набор процедур, предназначенных для допроса воздействия вирусной инфекции и в результате иммунологической реакции с использованием муриной модели инфекции Зика. Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет нам развивать механистическое понимание инфекции и иммунитета путем выявления степени распространения вируса по всему организму, поперечных физических барьеров и доступа к тканям. Эти методы позволяют детально понять вирусный патогенез и обеспечивают возможность вскрытия механизма защиты, предоставляемого вакцинами или терапевтическими средствами.
Здесь мы демонстрируем этот метод с использованием вирусной инфекции Зика мышей, но этот метод может быть применен к ряду вирусных инфекций, включая другие флавивирусы, такие как вирус Денге и альфавирусы, такие как вирус Чикунгунья. Сбор органов центральной нервной системы может быть сложной задачей, поэтому важно для человека, чтобы спланировать небольшой эксперимент, и быть готовым к практике методы заранее. Этот протокол позволяет быстро рассечение вирусного распространения в малых животных моделей с возможностью визуализировать, захвата и хранения экспериментальных данных.
Важно визуально продемонстрировать этот метод, чтобы позволить экспериментатору понять, как собрать органы центральной нервной системы. Также важно видеть уровень клеточного слияния и интенсивность вирусных очагов. Для начала используйте типсы, чтобы удалить шкуру зараженной мыши.
Обезглавить голову мыши ножницами, а затем удаление рук и ног. Чтобы собрать мозг, используйте зубчатые ножницы La Grange, чтобы прорезать череп через foramen magnum. Очистите череп типсами и вычерпыв мозг шпателем.
Используя сильные притупленные ножницы, удалить кости, окружающие позвоночник, а затем сократить через тазовую кость, чтобы разоблачить позвонков foramen на поясничном уровне. Затем удалите как можно больше мышц, окружающих позвоночник. Тщательно поместите скошенный кончик иглы внутри позвоночных foramen, избегая чрезмерного давления, чтобы предотвратить проникновение иглы позвонков тела.
Держите сильно, чтобы оказать давление на тело позвонка и иглы, и нажмите шприц поршень, чтобы изгнать шнур в чашку Петри. Немедленно перенесите спинной мозг в помеченную трубку и поместите в сухую ледяную ванну для дальнейшей гомогенизации. Для гомогенизации добавьте один миллилитр DMEM и гомогенизируйте образец в BeadBeater.
После обеспечения органов гомогенизации, центрифуги и aliquot образцов на льду и хранить в минус 80 градусов по Цельсию, пока это необходимо. В день анализа удалите гомогенизированные образцы из морозильной камеры минус 80 градусов по Цельсию и дайте им оттаять. С образцами на льду, разбавить вирус Зика в десять раз в первый колодец разбавленной пластины и использовать многоканальный пипетку, чтобы сделать десятикратное последовательное разбавления вниз пластины, меняя советы каждый раз.
Добавив 20 микролитров образца в 180 микролитров средств роста, измените советы пипетки между каждым разбавлением. Подготовьте плиту формирования фокуса путем извлекать средства от подготовленного плоского дна 96-наилучшим образом плиты покрывая virocells. Чтобы монослой не высыхал, немедленно добавьте 100 микролитров разбавления вируса к каждой хорошо в вироплате.
Используйте тот же набор советов, чтобы добавить от самой низкой до самой высокой концентрации. Рок пластины из стороны в сторону два-четыре раза и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа в течение одного-двух часов. Разогреть 2%метилцеллюлоза до комнатной температуры.
Затем разбавьте 2%-метилцеллюлозный раствор в средствах роста в соотношении примерно два к одному. После инкубации добавьте 125 микролитров метилцеллюлозы к каждому колодец из 96-х пластин. Инкубировать снова при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение 32 до 40 часов.
Чтобы исправить вироцелли, в шкаф биобезопасности добавить 50 микролитров 5%paraformaldehyde поверх слоя метилцеллюлозы в каждой хорошо из 96-хорошо пластин. Инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре. Кроме того, покрыть пластины с Parafilm и поместить их на четыре градуса по Цельсию на ночь.
После этого используйте пипетки для удаления наложения и смеся ячеек в одноразовый контейнер внутри шкафа биобезопасности. Аккуратно вымойте 150 микролитров PBS на колодец. Снимите PBS с пластин и удалите пластину из шкафа биобезопасности.
Повторите PBS мыть дважды, затем добавить 150 микролитров на хорошо один раз FFA мыть буфер и оставить при комнатной температуре в течение пяти до 10 минут, чтобы проницать фиксированные клетки. Далее, используйте первичные антитела Зика для обнаружения инфекции. Подготовка первичного антитела 4G2 при концентрации одного микрограмма на миллилитр в буфере окрашивания FFA.
Флик FFA мыть буфер из пластин, и добавить 50 микролитров первичного антитела в FFA окрашивания буфера для каждой хорошо. Затем запечатать пластины с Parafilm, или пластиковой пленкой, и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию. Подготовка вторичного идти анти-мышь HRP помечены антитела в концентрации от одного до 5000 в FFA окрашивания буфера.
После удаления раствора антител, мыть клетки три раза с 150 микролитров FFA мыть буфер на колодец. Удалите буфер мытья, щелкивая в раковину каждый раз. Пятно клеток со вторичным антителом в буфере окрашивания FFA на 50 микролитров на колодец и инкубировать один-два часа при комнатной температуре.
После этого, мыть клетки три раза с FFA мыть буфер, опять же, удаление мыть буфера, щелкивая в раковину каждый раз. Добавьте 50 микролитров субстрата TrueBlue в каждую колодец. Подождите от двух до 15 минут, пока пятна полностью определены с минимальным фоном.
После того, как пятна видны, мыть осторожно с водой, используя руку, чтобы оградить монослой от силы воды работает. Нажмите сухой на бумажные полотенца. Вскоре после этого используйте область вскрытия для ручного подсчета пятен в каждой из них или с использованием автоматизированного точечного счетчика.
В программном обеспечении ImmunoCapture выберите разбавление с легко различимым очагом от 20 до 200 на скважину для каждого образца и вычислите титер в фокус-образующих единицах на миллиметр, используя среднее значение дублирующих скважин. В этом эксперименте вирусная нагрузка была показана в тканях периферической и центральной нервной систем после того, как мышам Ифнара подкожно дали вирус Зика. Предел обнаружения был от 100 до 500 ФФУ на грамм, на основе органа.
При выполнении фокус-образного анализа технические ошибки могут привести к неоптимальным результатам. Токсичность органов, обусловленная высокой концентрацией печени, изменила чувствительность анализа. Когда вирусный титр в органе был ниже, чем токсичность, FFA не может точно записывать вирусные титры.
Клетки почек иллюстрировали токсичность с высокой концентрацией органов, но были преодолены вирусным титером при низких концентрациях органов. Энергичный пипетки или стирки может удалить монослой, что приводит к потерянным данным неточной отчетности titer результатов. Волокна или волосы, которые присутствуют в лаборатории скамейке абсорбентной бумаги, может загрязнять отдельные скважины и вызвать значительные ошибки при использовании автоматизированной программы подсчета.
Плотность клеток является еще одной проблемой, которая может существенно повлиять на успех фокус-формы анализа. Клетки с примерно 60%-ным слиянием в начале анализа, по сравнению с клетками, потрохающимися при 90%-м слиянии, показали драматическую разницу, влияя на фокус-формируя анализ. Планирование размера и масштабов эксперимента таким образом, чтобы сбор органов был завершен эффективно, является наиболее важной частью процедуры, а затем, начиная фокус-формы анализа с высоким качеством клеток.
Эта процедура была использована для количественной оценки вируса для нескольких вирусных семейств. Этот протокол также может быть адаптирован для проверки терапевтических соединений и количественно нейтрализации титеров антител. Эти методы используются для количественной оценки живого вируса, и соответствующие меры безопасности должны быть приняты в соответствии с руководящими принципами, изложенными в BMBL.
