このビデオでは、ジカ感染のマウスモデルを使用して、ウイルス感染の影響と結果として生じる免疫学的応答を尋問するために設計された一連の手順について説明します。このプロトコルは、ウイルスが体内に広がった程度を特定し、物理的な障壁を横断し、組織にアクセスすることによって、感染と免疫の機械学的理解を開発することを可能にするので、重要です。これらの技術は、ウイルスの病態の詳細な理解を可能にし、ワクチンまたは治療薬によって提供される保護のメカニズムを解剖する能力を提供する。
ここでは、マウスのジカウイルス感染を用いたこの方法を実証するが、この方法は、デング熱ウイルスやチクングニアウイルスのようなアルファウイルスのような他のフラビウイルスを含むウイルス感染の範囲に適用することができる。中枢神経系の臓器を収穫することは難しい場合があるので、小さな実験を計画し、事前に技術を練習する準備をすることが重要です。このプロトコルは、実験データを視覚化、キャプチャ、保存する能力を持つ小さな動物モデル内でのウイルス拡散の迅速な解剖を可能にする。
実験者が中枢神経系の器官を収穫する方法を理解できるように、この方法を視覚的に実証することが重要です。また、細胞の合流のレベルとウイルス病巣の強度を確認することも重要です。まず、感染したマウスのペルトを取り除くために鉗子を使用してください。
はさみでマウスの頭の首を切り落とし、続いて腕と脚を取り除きます。脳を収穫するには、鋸歯状のラ・グランジ・ハサミを使って頭蓋骨を頭蓋骨マグナムを切ります。鉗子で頭蓋骨を剥がし、へらで脳をすくい取ります。
強い鈍いはさみを使用して、背骨を取り巻く骨を取り除き、骨盤の骨を横切って切り取り、腰椎レベルで椎骨の前部を露出させる。その後、脊柱を囲む筋肉をできるだけ多く取り除きます。慎重に、針が椎体を不法侵入するのを防ぐために過度の圧力を避け、脊椎の前部の内側に針のベベル先端を置きます。
椎体と針に圧力をかけるために強く保持し、シリンジプランジャーを押してコードをシャーレに追い出します。直ちに標識チューブ内の脊髄を移し、さらに均質化するためにドライアイス浴中に入れます。均質化のために、DMEMを1ミリリットル加え、ビーズビーターでサンプルを均質化します。
臓器が均質化されていることを確認した後、氷の上に遠心分離機とアリコートサンプルを保存し、必要になるまでマイナス80°Cで保存します。アッセイの日に、マイナス80°Cの冷凍庫から均質化されたサンプルを取り出し、解凍させます。氷上のサンプルで、ジカウイルスを希釈プレートの最初の井戸に10倍に希釈し、マルチチャネルピペットを使用してプレートの下に10倍の連続希釈を行い、毎回先端を変更します。
20マイクロリットルのサンプルを180マイクロリットルの成長培地に加えることで、各希釈液の間にピペットチップを交換します。ビロセルを覆う準備された平らな底96ウェルプレートから培地を取り除くことによって、焦点形成プレートを準備します。単層が乾燥するのを防ぐために、ウイルス希釈液の100マイクロリットルをビロプレートの各ウェルに直ちに加える。
同じチップセットを使用して、最低濃度から最高濃度に追加します。ロックプレートサイドからサイドに2~4回、5%の二酸化炭素で摂氏37度で1~2時間インキュベートする。2%メチルセルロースを室温まで温めます。
次いで、成長培地中の2%メチルセルロース溶液を約2対1の割合で希釈する。インキュベーション後、96ウェルプレートの各ウェルにメチルセルロース成長培地125マイクロリットルを加えます。5%の二酸化炭素で摂氏37度で32〜40時間再びインキュベートする。
ビロセルを固定するには、バイオセーフティキャビネットで、96ウェルプレートの各ウェルのメチルセルロース層の上部に5%パラホルムアルデヒドの50マイクロリットルを追加します。室温で60分間インキュベートします。または、パラフィルムでプレートを覆い、一晩摂氏4度に置きます。
その後、ピペットを使用して、バイオセーフティキャビネット内の使い捨て容器に細胞からオーバーレイとメディアを取り除きます。150マイクロリットルのPBSでやさしく洗います。プレートからPBSを取り出し、バイオセーフティキャビネットからプレートを取り外します。
PBS洗浄を2回繰り返し、150マイクロリットルをFFA洗浄バッファーに1回加え、室温で5〜10分間放置して固定細胞を透過させます。次に、感染を検出するために一次ジカ抗体を使用する。一次抗体4G2を、FFA染色バッファーで1ミリリットル当たり1マイクログラムの濃度で調製します。
プレートからFFA洗浄バッファーをフリックし、各ウェルにFFA染色バッファーに一次抗体の50マイクロリットルを追加します。その後、パラフィルム、またはプラスチックフィルムでプレートを密封し、摂氏4度で一晩インキュベートします。二次行く抗マウスHRP標識抗体を1〜5,000の濃度でFFA染色バッファーで調製した。
抗体溶液を除去した後、150マイクロリットルのFFA洗浄バッファーで細胞を3回洗浄します。洗面液を取り外し、毎回シンクにフリックします。FFA染色バッファーで二次抗体を用いた細胞を1ウェルあたり50マイクロリットルで染色し、室温で1~2時間インキュベートする。
その後、細胞をFFA洗浄バッファーで3回洗浄し、再度、毎回シンクにフリックして洗浄バッファーを除去する。各ウェルにTrueBlue基板の50マイクロリットルを追加します。スポットが最小限の背景で完全に定義されるまで 2 ~ 15 分待ちます。
スポットが見えた後、水を流す力から単層を保護するために手で水でやさしく洗います。ペーパータオルをタップして乾かします。その直後に、解剖スコープを使用して各井戸のスポットを手動でカウントするか、自動スポットカウンターを使用します。
ImmunoCaptureソフトウェアでは、サンプルごとにウェルあたり20〜200の間で容易に識別された病巣を有する希釈を選択し、重複ウェルの平均を使用して1ミリメートルあたりの焦点形成単位の力価を計算する。この実験では、Ifnarマウスにジカウイルスを皮下に投与した後、末梢および中枢神経系組織にウイルス負担が示された。検出の限界は、臓器に基づいて、グラムあたり100〜500 FFUの間であった。
フォーカス形成アッセイを行う場合、技術的なミスは最適でない結果をもたらす可能性があります。肝臓の高濃度によって駆動される器官毒性は、アッセイの感度を変化させた。器官中のウイルス力価が毒性よりも低いとき、FFAはウイルス力価を正確に記録することができなかった。
腎臓細胞は高い臓器濃度の毒性を示したが、低臓器濃度でウイルス価によって克服された。激しいピペッティングや洗浄は、単層を除去することができ、失われたデータの力価の結果の不正確な報告につながる。ラボベンチ吸収性紙に存在する繊維または毛髪は、個々の井戸を汚染し、自動計数プログラムを使用する場合に重大なエラーを引き起こす可能性があります。
細胞密度は、焦点形成アッセイの成功に劇的に影響を与える別の問題です。アッセイ開始時に約60%の合流度の細胞は、90%のコンフルエンシーでメッキされた細胞と比較して、焦点形成アッセイに影響を与える劇的な違いを示した。臓器収穫が効率的に完了するように実験の規模と範囲を計画することは、手順の最も重要な部分であり、続いて高品質の細胞でフォーカス形成アッセイを開始する。
この手順は、複数のウイルスファミリーのウイルスを定量化するために使用されています。このプロトコルはまた、治療化合物のスクリーニングおよび中和抗体力剤の定量に適応することができる。これらの技術は、生きたウイルスを定量化するために使用され、適切な安全手順は、BMBLに定められたガイドラインに従って取られるべきである。
