Con el objetivo de reducir las pruebas con animales y debido a la variabilidad de la prueba NH, la OMS alienta a desarrollar enfoques in vitro para evaluar la potencia de la vacuna antirrábica. Esta prueba ELISA muestra una buena concordancia con una prueba NH clásica en el reconocimiento de la forma inmunogénica de la glicoproteína, muestra una alta sensibilidad, y se puede realizar dentro de un solo día. La evaluación de la potencia de la vacuna antirrábica in vitro por ELISA es una alternativa a la prueba NH in vivo.
Está promovido por los fabricantes y laboratorios nacionales de control. Es fundamental distribuir volúmenes de tamaño premétrico por duplicado para cada dilución y secar bien la placa en papel absorbente después de lavados para evitar comenzar este procedimiento, poner en equipo de protección personal adecuado, incluyendo abrigo desechable, guantes, máscara y vasos. Tratar los materiales contaminados sumergiéndolos en una solución de hipoclorito sódico al 2,6% durante 30 minutos para su descontaminación.
A continuación, establezca una placa de inmunoensayo de 96 pozos y agregue 200 microlitros del anticuerpo monoclonal diluido en el tampón de carbonato a cada pozo. Cubra la placa con película adhesiva e incubar la microplaca a 37 grados Centígrados durante tres horas en un ambiente humidificado. A continuación, aspirar cuidadosamente y transferir el contenido del pozo a un receptor que contenga una solución de hipoclorito sódico al 2,6%.
Invierta la microplaca y déjela secar en papel absorbente a temperatura ambiente durante cinco minutos. Primero, agregue 300 microlitros del búfer de pasivación a cada pocóyo. Cubra la placa con película adhesiva e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Después de esto, transferir el contenido del pozo a uno que contenga una solución de 2,6% de hipoclorito sódico. Para lavar la placa, agregue 300 microlitros del tampón de lavado a cada pozo. A continuación, aspirar cuidadosamente y transferir el contenido del pozo a un recipiente que contenga una solución de 2,6% de hipoclorito sódico.
Repita este proceso de lavado cinco veces más para lavar ampliamente la placa sensibilizada. Después de esto, invierta la microplaca y déjela secar en un pedazo de papel absorbente a temperatura ambiente durante un minuto. Reconstituir la vacuna de referencia en un mililitro de agua destilada de forma que la concentración final de glicoproteína del virus de la rabia sea de 10 microgramos por mililitro.
Preparar una dilución 10 veces de la vacuna de referencia reconstituida en el diluyente para alcanzar una concentración de glicoproteína del virus de la rabia de un microgramo por mililitro. A continuación, realice seis diluciones en serie dos veces de esta vacuna de referencia en el diluyente, tal como se describe en la tabla uno del protocolo de texto. Distribuir 200 microlitros del diluyente en pozos duplicados para servir como control ciego y 200 microlitros por pozo para cada dilución de vacuna de referencia por duplicado.
A continuación, prepare una dilución de 10 veces la vacuna probada en el diluyente y prepare siete diluciones en serie de la vacuna probada en diluyente como se describe en la tabla dos del protocolo de texto. Distribuya 200 microlitros de cada dilución de vacuna probada por duplicado a cada pocótela de la microplaca. Cubra la microplaca con película adhesiva e incubar a 37 grados centígrados durante una hora.
Después de esto, retire la película. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito sódico al 2,7%. Para lavar la placa, añadir 300 microlitros de tampón de lavado a cada pozo, aspirar cuidadosamente y transferir el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito sódico al 2,6%.
Repita el proceso de lavado cinco veces más para eliminar el antígeno no unido y conservar los recortadores de proteína G unidos al anticuerpo recubierto. Invierta la microplaca lavada y déjela secar en un pedazo de papel absorbente a temperatura ambiente durante un minuto. A continuación, distribuya 200 microlitros de la dilución recomendada de peroxidasa etiquetada con anticuerpo monoclonal D1 en diluyente a cada pocóvolo.
Cubra la microplaca con película adhesiva e incubar a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, retire la película, aspire cuidadosamente y transfiera el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,6%. Para lavar la microplaca, agregue 300 microlitros de tampón de lavado a cada pocóyo.
Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito sódico al 2,6%. Repita este proceso de lavado cinco veces más para eliminar el anticuerpo etiquetado con peroxidasa no enlazada. Invierta la microplaca lavada y déjela secar en un pedazo de papel absorbente a temperatura ambiente durante un minuto.
A continuación, distribuya 200 microlitros de solución de sustrato-cromógeno en cada pozo. Selle la microplaca con película e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. A continuación, agregue 50 microlitros de solución de parada en cada pozo para detener la reacción.
Limpie cuidadosamente la parte inferior de la microplaca y colóquela en el espectrofotómetro. Determinar la densidad óptica a 492 nanómetros para todos los pozos utilizados. Recopile estos datos en un archivo de hoja de cálculo para su análisis.
Después de esto, cree gráficas tanto para la curva de la vacuna de referencia como para los valores de densidad óptica descritos en el protocolo de texto. En este estudio, la prueba ELISA in vitro se utiliza para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia. Aquí se muestran valores representativos de densidad óptica de un experimento típico.
Estos valores se utilizan para dibujar la curva de la vacuna de referencia trazando la densidad óptica media para las diferentes diluciones de la vacuna de referencia en el eje vertical y la concentración de la glicoproteína en el eje horizontal. A continuación, se estima el contenido de glicoproteína de la vacuna analizada utilizando esta curva. La evaluación es precisa para las diluciones que tienen un valor medio de densidad óptica en el área de revestimiento de la curva de la vacuna de referencia.
Teniendo en cuenta la dilución de uno a 40, la proyección vertical de OD 1534 en el eje X corresponde a 500 nanogramos por mililitro. Por lo tanto, la vacuna probada se estima en 20 microgramos por mililitro de glicoproteína. Cuando se establece la potencia in vitro, es necesario comparar la vacuna probada con la referencia seis estándares internacionales de la OMS calibrados en unidades internacionales.
El mismo método se puede utilizar con otros anticuerpos para ampliar la detección de más cepas vacunales, incluidas las utilizadas en vacunas veterinarias que clásicamente son más variables. Los anticuerpos también se pueden utilizar en la competencia para la valoración de anticuerpos antirabies en el suero equino o humano. Se deben tomar precauciones con vacunas que no estén inactivadas o con virus.
Asegúrese de usar equipo de protección personal, usar guantes y descontaminar todo correctamente. Además, tenga cuidado con los comprimidos de ya que son cancerígenos y con la solución ácida de hipoclorito sódico.
