Cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas. México es un país con un considerable potencial ganadero. Los estados con mayor producción ganadera contienen regiones tropicales húmedas y regiones secas que están en riesgo de brotes de rabia debido a la presencia del murciélago vampiro, Desmodus rotundus, el principal transmisor de la rabia.
La detección del gen de la nucleoproteína N del virus de la rabia se utiliza principalmente para el diagnóstico de rabia mediante pruebas moleculares. Utilizando enfoques basados en PCR, se pueden detectar cantidades mínimas de un agente infeccioso en una muestra clínica a través de la amplificación selectiva y repetitiva de una secuencia de nucleótidos de ADN. qRT-PCR se basa en la detección y cuantificación de una molécula donde los aumentos de la señal de fluorescencia son en proporción directa a la cantidad de producto PCR en una sola reacción.
A medida que aumenta el número de copias del objetivo de ácido nucleico, también lo hace la fluorescencia. Basándose en esto, el objetivo del estudio era utilizar qRT-PCR cuantitativo para determinar el número de partículas virales en diferentes estructuras anatómicas de cerebros bovinos, después de la muerte, debido a la infección por rabia. El ARN total se extrajo directamente de cerebros bovinos utilizando un método de extracción orgánica de acuerdo con el siguiente protocolo.
Utilice 100 miligramos de tejido cerebral de cada estructura anatómica para extraer ARN total utilizando un reactivo disponible comercialmente que contiene isoticianato de guanidinio. Homogeneizar manualmente un total de 100 miligramos de tejido de cada estructura en un mililitro del reactivo de isoticianato de guanidinio mediante vórtice utilizando un homogeneizador Dounce con un pequeño pestle dentro del microtubo durante 15 segundos a máxima velocidad. Incubar las muestras en hielo durante cinco minutos, y luego añadir 200 microlitros de cloroformo.
Mezcle las muestras vigorosamente durante 15 segundos. Incubar en hielo durante dos o tres minutos, y luego centrifugar a 12.000 x g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera la fase acuosa a un tubo limpio y agregue 500 microlitros de alcohol isopropílico.
Incubar las muestras durante 15 minutos a 21 grados centígrados. Centrífuga las muestras a 12.000 x g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar el sobrenadante acuoso por pipeteo.
El ARN aislado estará presente como pellet en el tubo. A continuación, lave el pellet de ARN con un mililitro de 75% de etanol pipeteando y centrífuga a 7.500 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante y secar al aire el pellet de ARN a temperatura ambiente, 21 grados centígrados.
A continuación, diluya el pellet en 50 microlitros de agua libre de nucleasa. Determine la concentración y calidad del ARN en 260 nanómetros mediante un espectrofotómetro. La transcripción in vitro genera ARNM de un gen objetivo.
Utilice un par de imprimación que amplíe el gen COMPLETO RABV N y uno que se utilice como control positivo para el ensayo qRT-PCR. Estas imprimaciones están diseñadas para amplificar el gen COMPLETO RABV N, y para añadir un promotor que reconozca la polimerasa T7. Para amplificar todo el gen N RABV, utilice las imprimaciones trans y RAB hacia adelante y hacia atrás, y un kit de PCR de alta fidelidad.
Para cada reacción, prepare una mezcla maestra de PCR añadiendo a un búfer de reacción de tubo PCR limpio con 10 micromolares de cada imprimación y 0,5 unidades de polimerasa de alta fidelidad. Para utilizar el producto PCR como plantilla para la síntesis in vitro y eliminar componentes de la reacción enzimática, purifique el producto PCR utilizando un kit concentrador basado en columnas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Y luego cuantificar usando un espectrofotómetro.
Para la síntesis de ARN, utilice un kit de transcripción in vitro con la siguiente mezcla de reacción: cinco microlitros T7 transcripción 5X buffer, 1.9 microlitros de cada nucleótido de trifosfato, 10 microgramos de ADN RABV N purificado, y 2.5 microlitros de la mezcla enzimática. A continuación, incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante cuatro horas. A continuación, añadir un microlitro de una unidad por microgramos Rnase-Free DNase a la mezcla de reacción e incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados para eliminar la contaminación del ADN.
Purificar el ARN transcrito in vitro y luego concentrarlo usando fenol:cloroformo:alcohol isoamilo a una proporción de 25:24:1. Resuspend el pellet de ARN purificado en 70 microlitros de tampón TE, y luego almacenarlo a 80 grados centígrados hasta su uso. Repita el protocolo PCR hasta obtener aproximadamente cinco microgramos de producto PCR.
Después de la purificación y concentración, el ARNM del gen N transcrito in vitro estará presente a una concentración de 4.711 microgramos por microlitro. Confirme que el ARNm transcrito in vitro corresponde al gen N siguiendo el paso cinco de este protocolo, y utilícelo como un control positivo para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real, qRT-PCR. Para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real, utilice una transcripción de ARNm in vitro para codificar el gen N completo como un control positivo.
Junto con un kit comercial qRT-PCR de un solo paso, utilizando sondas de hibridación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice la sonda en las imprimaciones descritas por Coronado y su compañero de trabajo en 2010 para detectar una región conservada de la RABV utilizando las siguientes condiciones de ciclismo térmico. Realice diluciones en serie del ARNm transcrito in vitro canalizando en serie un microgramos por microlitro de ARNM en tubos hasta que se obtengan seis diluciones desacopladas.
Prepare tubos a un volumen de 100 microlitros en triplicado para su uso en la creación de la curva estándar. Realice qRT-PCR como se describió anteriormente. Realice qRT-PCR en un ciclor térmico con un rotor procesando las diversas muestras cerebrales simultáneamente con las reacciones en ejecución para crear una curva estándar y utilizar controles positivos, controles negativos y sobrenautas aislados del cultivo celular.
Para evaluar el límite de detección, eficacia de la prueba y sensibilidad de la prueba, utilice una curva estándar en triplicado en las mismas condiciones. Para la detección del gen RABV N, utilice el ARN a partir de muestras de campo, controles positivos, controles negativos y sobrenautas de cultivo celular para realizar qRT-PCR utilizando el kit pcr descrito anteriormente. Para determinar el número de copias del genoma rabv presentes en las muestras cerebrales bovinas, obtener datos de TC de la curva estándar y muestras biológicas, y de los interpolados desde la ecuación de la curva de calibración Esta cifra muestra tejidos cerebrales bovinos que exhiben tinción positiva de acuerdo con la inmunofluorescencia directa.
Los resultados muestran 100%100%83.3%66% y 50% positividad para RABV en la corteza, tálamo, medulla, pons y cuerno respectivamente. Estos resultados confirman los resultados anteriores, y al menos tres de las estructuras diseccionadas de cada cerebro fueron positivas para RABV. Por otro lado, la ecuación de la curva estándar muestra la relación entre la cantidad de contenido genético rabv en la muestra y el tamaño del fragmento amplificado pcr.
La cantidad de contenido genético rabv en nanogramos se dedujo mediante la interpolación de los valores de TC en la curva de calibración utilizando la ecuación presentada en esta figura. Usando esta ecuación, se encontró que el límite de detección de una por vez de 10 a los quintos microgramos por microlitro de ARN viral correspondía a 36 copias del genoma de RABV. Estos resultados demuestran que el ensayo es sensible y se puede utilizar para detectar el virus en muestras que contienen un bajo número de copias del gen RABV N.
La eficiencia del ensayo se calculó utilizando la pendiente de la curva estándar, que era de 3,28. Las muestras utilizadas para qRT-PCR mostraron amplificación del gen RABV N. Para determinar el número de copias virales presentes, los valores de TC de cada muestra se interpolaron utilizando la ecuación de curva de calibración.
Los resultados obtenidos en nanogramos se sustituyeron por la fórmula descrita aquí. Esta tabla muestra los resultados comparativos entre qRT-PCR y DFA. Los resultados de los ensayos qRT-PCR fueron consistentes con los obtenidos utilizando DFA.
Según los resultados obtenidos en la prueba qRT-PCR en los casos C y D, el tálamo es la estructura que posee el mayor número de copias del gen RABV N. Esto sugiere que la infección temprana de neuronas hipotalámicas y talámicas es importante en el desarrollo de la enfermedad, dado que estas neuronas controlan las funciones vegetativas de un animal. Los números de copia del gen RABV N que se detectaron en cada estructura de cada muestra son: la sensibilidad y especificidad de la prueba qRT-PCR estamos 100% ya que todas las muestras fueron positivas.
Este resultado es consistente con los diagnósticos iniciales de las muestras. qRT-PCR es una técnica altamente sensible. Algunos de los pasos son críticos para obtener los mejores resultados.
Uno de ellos es el manejo adecuado de muestras para la extracción de ARN. Este paso es crucial ya que el ARN se degrada fácilmente y, por lo tanto, los resultados podrían verse afectados. Considere mantener la muestra en condiciones frías, aproximadamente cuatro grados centígrados durante el proceso.
Además, considere que se llevan a cabo varias rondas de aplicación de ITP como se menciona en la transcripción in vitro. El ensayo qRT-PCR realizado en este estudio podría detectar tan solo 36,3 copias del gen RABV N por miligramo de tejido. Las estructuras cerebrales más adecuadas para qRT-PCR incluían la corteza y el tálamo.
Esto se basa en las observaciones de que se detectaron concentraciones más altas del gen RABV N en estas estructuras, y que también se encontró que eran positivas utilizando la prueba de referencia rabv. La prueba fue capaz de detectar concentraciones muy bajas, 0.00023 por 10 a la novena copia del virus en varias muestras. Además de cuantificar las partículas virales en la muestra, la prueba parece proporcionar una buena herramienta alternativa de diagnóstico e investigación para la detección de RABV presentada aquí.
