동물 실험을 줄이는 것을 목표로 하고 NH 시험의 가변성 때문에 WHO는 광견병 백신 효능을 평가하기 위한 체외 접근법을 개발하도록 장려합니다. 본 ELISA 시험은 당단백질의 면역원성 형태를 인식하는 고전적인 NH 시험과 양호한 일치를 나타내며, 고감도를 나타내며, 하루 만에 수행될 수 있다. ELISA에 의한 시험관 내 광견병 백신 효능의 평가는 생체 내 NH 시험의 대안이다.
그것은 제조 업체및 국가 통제 실험실에 의해 추진된다. 이 절차를 시작하기 위해 세정 후 흡수성 용지에 사전 크기의 볼륨을 복제하고 소용 용지에 접시를 잘 말리는 것이 중요합니다. 오염된 물질을 2.6%의 하이포염 나트륨용액에 30분 동안 담근 후 오염된 물질을 치료하여 오염물질을 제거합니다.
다음으로, 96웰의 면역분석판을 설정하고 탄산염 완충제에서 희석된 단클론 항체의 200마이크로리터를 각각 양호하게 첨가한다. 접착제 필름으로 접시를 덮고 가습 환경에서 3 시간 동안 섭씨 37도에서 마이크로 플레이트를 배양하십시오. 그런 다음 신중하게 흡인하고 2.6 %의 염화 나트륨의 용액을 포함하는 수령인으로 우물 함량을 전송합니다.
마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡수성 용지에 5 분 동안 건조시키십시오. 먼저 각 웰에 300마이크로리터의 통과 버퍼를 추가합니다. 접착제 필름으로 접시를 덮고 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양하십시오.
그 후, 2.6%의 하이포염소산나트륨용액을 함유한 웰의 내용물들을 하나로 옮기는다. 접시를 씻으려면 각 우물에 300 마이크로리터를 첨가하십시오. 그런 다음 신중하게 흡인하고 2.6 %의 하이포클로리트 나트륨의 용액을 포함하는 수령인으로 우물 함량을 전송합니다.
이 세탁 과정을 5회 더 반복하여 감광판으로 광범위하게 씻어주세요. 그 후 마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡수성 용지 조각을 1분 동안 건조시키십시오. 광견병 바이러스 당단백질의 최종 농도가 밀리리터 당 10 마이크로그램인 증류수 의 1 밀리리터에서 기준 백신을 재구성한다.
희석제에서 재구성된 기준 백신의 10배 희석을 준비하여 밀리리터당 1마이크로그램의 광견병 바이러스 당단백질 농도에 도달한다. 다음으로, 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명된 대로 희석제에서 이 기준 백신의 6개의 직렬 2배 희석제를 수행한다. 중복 우물에 희석제 200마이크로리터를 분배하여 각 기준 백신 희석에 대해 시각 장애인 대조군과 200마이크로리터를 복제하여 사용할 수 있습니다.
그런 다음 희석제에서 테스트된 백신의 10배 희석을 준비하고 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 대로 희석제에서 테스트된 백신의 7배 연속 희석제를 준비한다. 마이크로 플레이트의 각 웰에 복제하여 각 테스트 된 백신 희석의 200 마이크로 리터를 배포합니다. 접착제 필름으로 마이크로 플레이트를 덮고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양하십시오.
이 후 필름을 제거합니다. 신중하게 흡인하고 2.7 %의 나트륨 hypochlorite 용액을 포함하는 수령인으로 각 우물의 내용을 전송합니다. 접시를 세척하려면 각 웰에 300 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 각 웰의 내용을 조심스럽게 흡인하고 2.6 %의 hypochlorite 나트륨 용액을 포함하는 수령인으로 옮겨 넣습니다.
언바운드 항원을 제거하고 코팅된 항체에 결합된 G-단백질 트리머를 보존하기 위해 세척 과정을 5회 더 반복한다. 세척된 마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡수성 용지 한 조각에서 1분 동안 건조시키십시오. 그런 다음 각 웰에 희석제에 D1 단클론 항체를 표시과 산화의 권장 희석의 200 마이크로 리터를 배포.
접착제 필름으로 마이크로 플레이트를 덮고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양하십시오. 다음으로, 필름을 제거하고, 신중하게 흡인하고, 2.6%의 하이포염소산나트륨 용액을 함유한 수령인으로 각 우물의 내용을 전송한다. 마이크로 플레이트를 세척하려면 각 웰에 300 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가합니다.
신중하게 흡인하고 2.6 %의 나트륨 hypochlorite 용액을 포함하는 수령인으로 각 우물의 내용을 전송합니다. 이 세척 과정을 5회 더 반복하여 불바운드 peroxidase 라벨이 부착된 항체를 제거합니다. 세척된 마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡수성 용지 한 조각에서 1분 동안 건조시키십시오.
다음으로, 각 우물에 기질 염색체 용액 200 마이크로리터를 분배합니다. 마이크로 플레이트를 필름으로 밀봉하고 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 50 마이크로리터의 정지 용액을 각 우물에 추가하여 반응을 중지합니다.
마이크로 플레이트의 바닥을 조심스럽게 닦고 분광측에 놓습니다. 사용되는 모든 웰에 대해 492 나노미터의 광학 밀도를 결정합니다. 분석을 위해 스프레드시트 파일에서 이 데이터를 수집합니다.
이 후 텍스트 프로토콜에 설명된 참조 백신 곡선과 광학 밀도 값 모두에 대한 플롯을 만듭니다. 이 연구에서는, 시험관 내 ELISA 시험은 광견병 백신 효능을 평가하기 위하여 이용됩니다. 일반적인 실험에서 대표적인 광학 밀도 값이 여기에 표시됩니다.
이러한 값은 수직 축상상에 있는 기준 백신의 상이한 희석을 위한 평균 광학 밀도및 수평 축상에 있는 당단백질의 농도를 플로팅하여 기준 백신 곡선을 그리는 데 사용된다. 시험된 백신의 당단백질 함량은 이 곡선을 사용하여 추정됩니다. 이 평가는 기준 백신 곡선의 라이너 영역에서 평균 광학 밀도 값을 갖는 희석에 대해 정확합니다.
1대 40의 희석을 고려하여 x축에서 OD 1534의 수직 투영은 밀리리터당 500 나노그램에 해당합니다. 따라서 테스트된 백신은 당단백질의 밀리리터 당 20 마이크로그램으로 추정됩니다. 시험관 내 효능이 확립되면, 시험된 백신을 국제 단위로 보정된 WHO 국제 표준 6개 기준과 비교할 필요가 있다.
동일한 방법은 고전적으로 더 가변적인 수의학 백신에 사용된 것을 포함하여 더 많은 백신 균주의 검출을 확대하기 위하여 그밖 항체와 함께 이용될 수 있습니다. 항체는 또한 말 또는 인간 혈청에 있는 항체 항체의 적정을 위한 경쟁에서 이용될 수 있습니다. 예방 조치는 비활성화되지 않았거나 바이러스가 없는 백신으로 취해야 합니다.
개인 보호 장비를 사용하고 장갑을 착용하고 모든 것을 적절하게 오염 제거하십시오. 또한 발암성 및 산성 나트륨 저염용정제에 주의하십시오.
