Este protocolo se puede utilizar para realizar la entrega mejorada por convección en pequeños roedores utilizando un sistema de catéter escalonado para la perfusión uniforme ajustable de las regiones cerebrales objetivo. La ventaja de la administración mejorada por convección es que permite la entrega de sustancias en la región de interés evitando la barrera blood - brain con poco daño tisular o reflujo. Esta técnica es principalmente útil para la entrega de sustancias terapéuticas como anticuerpos en el cerebro.
Y por lo tanto se puede utilizar para apuntar a muchas condiciones neurológicas. Demostrando el procedimiento estará Michal Beffinger, un post-doc de mi laboratorio. Comience cortando un pedazo de tubo capilar de sílice fusionada con un diámetro interior de 0,1 milímetros y un espesor de pared de 0,325 milímetros a una longitud de 30 milímetros.
Después de examinar el tubo para grietas utilice un microforge para pulir los extremos para asegurar que las aberturas del tubo tienen una superficie lisa. A continuación, monte una aguja de calibre 27 en una jeringa de 10 micro litros y coloque la jeringa en un robot estereotáctico. Utilice el robot para mover la jeringa sobre una superficie dura y toque la superficie con la punta de la aguja.
Después de notar esta posición elevar la aguja para permitir la colocación de la sílice fusionada capilar dentro de la aguja de tal manera que 20 milímetros del capilar sobresale de la aguja. Utilice una pipeta para esparcir uniformemente dos microlitros de adhesivo de cianoacrilato de alta viscosidad sobre el capilar a partir de la aguja metálica y terminando diez milímetros por encima del extremo inferior del capilar. Utilice el robot estereotáctico para bajar la aguja metálica hasta que la punta de la aguja esté un milímetro sobre la superficie de referencia para fijar el capilar de sílice fusionada en la aguja metálica formando un paso de un milímetro desde la punta de la aguja metálica.
Retire cualquier exceso de pegamento que se forme al final de la aguja metálica para evitar plantar el paso del catéter. Compruebe la punta bajo un microscopio para confirmar que se ha eliminado todo el exceso de pegamento. A continuación, espere 15 minutos hasta que el pegamento se endurezca y retire la jeringa con el catéter del robot.
Para la prueba de catéter de paso cortar gel solidificado 0.6%agarosa en bloques de 20 por 20 milímetros y llenar manualmente la jeringa del catéter escalonado con 10 microlitros de solución azul filtrada 0.4%trypan. Usando el robot estereotáctico, dispensar un microlitro de tinte a 0,2 micro litros por minuto para evaluar el sellado del paso del catéter durante el procedimiento de fijación. La solución azul tripano debe ser visible únicamente en la punta del catéter.
Limpie el tinte con un pañuelo de papel y coloque un bloque de agarosa en el robot estereotáctico. Calibrar el robot dijo que la punta del catéter se hace referencia contra la superficie del bloque de agarosa. Establezca una secuencia de proporción de volúmenes de inyección de acuerdo con el plan experimental específico.
Para inyectar la solución en el putamen caudado murino, ajuste la inyección a un frente de un milímetro y de un lado y medio a dos milímetros desde la posición del bregma a una profundidad de 3,5 milímetros. Cuando la aguja está en posición, inicie el procedimiento de administración mejorado de convección e inyecte cinco microlitros de solución azul tripano en el bloque de agarosa. Evaluar la forma de la nube azul tripano en la agarosa y para detectar posibles fugas a lo largo del tracto del catéter.
No debe ser visible ningún flujo de fondo importante sobre la punta de la aguja metálica. Después de la inyección deje el catéter en su lugar durante dos minutos antes de retraer la aguja a un milímetro por minuto para asegurar una correcta dispersión del líquido en el cerebro y el sellado del tracto de inyección durante la extracción. Coloque un nuevo bloque de agarosa en el robot e inicie una segunda inyección de un microlitro a 0,2 micro litros por minuto para evaluar la obstrucción del catéter dentro de la agarosa.
El trypan azul debe formar de nuevo una nube desde la punta del catéter inmediatamente después del inicio de la inyección. A continuación, evalúe si el volumen sobrante de la jeringa corresponde a 3 microlitros, ya que cualquier variación podría indicar una fuga de líquido a través del montaje del catéter o del émbolo de la jeringa. Para la inyección de anticuerpos en el estriado murino, confirme la falta de respuesta al pellizco de la piel en un ratón anestesiado y afeite la cabeza con un recortador de cabello.
Desinfectar la piel con hisopos de algodón empapados en solución de yodo. Usa un bisturí para hacer una incisión cutánea de 10 milímetros a lo largo del acabado de la línea media craneal a nivel de los ojos. Fije el ratón en el marco estereotáctico usando la abrazadera de la nariz y las barras de los oídos, teniendo cuidado de que la superficie del cráneo esté horizontal y firmemente asegurada.
Coloque la jeringa en el robot estereotáctico y sincronice la broca con la punta del catéter en un punto de referencia. Utilice fórceps para retraer la piel y localizar el bregma en la superficie del cráneo. Bregma de referencia en el software utilizando la punta de la broca y mueva el taladro a un frontal de un milímetro y dos milímetros lateral desde la posición del bregma.
Taladre un orificio de rebaba teniendo cuidado de no dañar la durama y mover la jeringa sobre el orificio de la rebaba. Dispensar 0,5 a un microlitro de la jeringa para asegurarse de que no queden burbujas de aire en el catéter. Iniciar la entrega mejorada por convección como se ha demostrado, observando la superficie del cráneo para cualquier rastro de flujo de líquido desde el punto de inyección.
Al final de la administración y la extracción del catéter, inicien la bomba de inyección a 0,2 micro litros por minuto para comprobar si hay evidencia de obstrucción del catéter durante la inyección. Si no se produjo obstrucción, se debe observar inmediatamente una gota de mezcla de inyección procedente de la punta del catéter. En esta imagen de una nube de color azul tripano formando después de la inyección de un microlitro de tinte a 0,5 micro litros por minuto utilizando un catéter mejorado de convección como se ha demostrado, no se hizo visible ningún reflujo a lo largo del tracto de la aguja durante el comienzo del paso del catéter.
Y la nube dispersa formó una forma esférica deseada. En esta imagen usando una aguja de extremo contundente, sin embargo, se pudo observar un reflujo significativo. En particular, la administración mejorada de la convección permite la perfusión de grandes volúmenes en el cerebro murino de una manera uniforme y menos dañina de los tejidos en comparación con la inyección convencional.
En ambos tipos de parto existe un perfil de distribución típico de partículas de anticuerpos y dextrán sobre el cuerpo calloso. Sin embargo, el perfil de dispersión del anticuerpo inyectado es más difuso que el observado para el dextrano de alto peso molecular después de la administración mejorada de la convección, ejemplificando las diferencias en la distribución entre diferentes infusados. Como el catéter puede obstruirse potencialmente durante la perfusión cerebral, es importante comprobarlo inmediatamente después dispensando lentamente un pequeño volumen de infusate.
Este procedimiento puede servir como una manera de entregar compuestos farmacológicamente activos al cerebro y debe ser seguido por un control estrecho de los síntomas de la enfermedad y los efectos secundarios esperados. Esta técnica permite la infusión de una región cerebral precisa con terapias incluyendo anticuerpos, abriendo nuevas posibilidades para el desarrollo de terapias dirigidas al sistema nervioso central.
