이 프로토콜은 표적 뇌 영역의 조절 가능한 균일 한 관류에 대한 단계 카테터 시스템을 사용하여 작은 설치류에서 대류 강화 된 전달을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 대류 강화 전달의 장점은 조직 손상이나 역류가 거의 없는 혈액-뇌 장벽을 우회하여 관심 영역으로 물질을 전달할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 주로 뇌로 항체와 같은 치료 물질의 전달에 유용합니다.
따라서 많은 신경 학적 조건을 대상으로 사용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 의사 인 Michal Beffinger가 될 것입니다. 0.1 밀리미터의 내지름과 0.325 밀리미터의 벽 두께를 30밀리미터로 융합된 실리카 모세관 튜브 를 절단하여 시작합니다.
균열에 대한 튜브를 검사 한 후 튜브 개구부가 매끄러운 표면을 보장하기 위해 끝을 가열하기 위해 마이크로 포지를 사용합니다. 다음으로, 10 마이크로 리터 주사기에 27 게이지 바늘을 장착하고 주사기를 스테레오전술 로봇에 배치합니다. 로봇을 사용하여 주사기를 단단한 표면 위로 이동하고 바늘 끝으로 표면을 만지도록 합니다.
이 위치를 지적한 후 바늘을 상승시키는 것은 바늘의 20밀리미터가 바늘로부터 돌출되는 바늘 의 내부에 융합된 실리카 모세관의 배치를 가능하게 한다. 파이펫을 사용하여 금속 바늘에서 시작하여 모세혈관의 하부 끝 위로 10밀리미터 를 마무리하는 모세관 위에 고점도 시아노아크레이트 접착제의 두 마이크로리터를 균일하게 퍼집니다. 스테레오전술 로봇을 사용하여 바늘 끝이 기준 표면을 1밀리미터 이상 상회할 때까지 금속 바늘을 낮추어 금속 바늘 끝에서 1밀리미터 단계를 형성하는 금속 바늘의 융합된 실리카 모세관을 고정한다.
카테터 스텝을 심지 않도록 금속 바늘 끝에 형성되는 과도한 접착제를 제거하십시오. 현미경의 밑에 팁을 확인하여 모든 초과 접착제가 제거되었는지 확인합니다. 그런 다음 접착제가 로봇에서 카테터로 주사기를 굳고 제거할 때까지 15분 간 기다립니다.
스텝 카테터 테스트를 위해 0.6%의 아가로즈 젤을 20%로 20mm 블록으로 자르고 수동으로 10 마이크로리터의 여과 된 0.4% 트라이팬 블루 솔루션으로 스텝 카테터 주사기를 채웁니다. 스테레오전술 로봇을 사용하여 분당 0.2 마이크로 리터에 1개의 미세리터를 분배하여 고정 절차 중에 카테터의 스텝의 밀봉을 평가합니다. 트라이판 블루 솔루션은 카테터 의 끝에만 표시되어야합니다.
종이 조직으로 염료를 닦고 입체 로봇에 아가로즈 블록을 놓습니다. 카테터의 끝이 아가로즈 블록의 표면에 대해 참조되는 로봇을 교정합니다. 특정 실험 계획에 따라 사출량의 비율 시퀀스를 설정합니다.
뮤린 카우다테 푸타멘에 용액을 주입하려면, 3.5 밀리미터의 깊이에서 브레그마 위치에서 1 밀리미터 정면과 1 ~ 2 밀리미터 측측에 주입을 설정합니다. 바늘이 위치에있을 때 대류 향상 전달 절차를 시작하고 아가로즈 블록에 trypan 블루 용액의 5 마이크로 리터를 주입. 아가로즈의 트라이판 블루 클라우드 모양과 카테터 관을 따라 누출 가능성을 평가합니다.
금속 바늘 의 끝에 큰 역류를 볼 수 없습니다. 주사 후 카테터를 분당 1밀리미터로 후퇴하기 전에 카테터를 2분 동안 제자리에 두고 제거 하는 동안 뇌로 유체의 적절 한 분산을 보장 하 고 제거 하는 동안 주사 관의 밀봉. 로봇에 새로운 아가로즈 블록을 넣고 아가로즈 내의 카테터 막힘을 평가하기 위해 분당 0.2 마이크로 리터에서 마이크로 리터 1개를 두 번째 주입합니다.
트라이판 블루는 주사가 시작된 직후 카테터 끝에서 구름을 다시 형성해야 합니다. 그런 다음 주사기의 남은 부피가 3 마이크로리터에 해당하는지 여부를 평가하여 어떤 변형도 카테터 장착 또는 주사기 플런저를 통해 유체의 누출을 나타낼 수 있습니다. 뮤린 스트루에 항체 주입을 위해 마취 마우스에서 피부 꼬집어 에 대한 반응의 부족을 확인하고 머리 트리머로 머리를 면도.
요오드 용액에 담근 면봉으로 피부를 소독하십시오. 메스를 사용하여 눈 높이에서 마무리되는 두개골 중간선을 따라 10mm 의 피부 절개를 합니다. 두개골 표면이 수평이고 단단히 고정되어 있음을 주의하여 코 클램프와 이어 바를 사용하여 입체 프레임의 마우스를 고정합니다.
주사기를 스테레오전술 로봇에 넣고 드릴 비트를 카테터 끝과 참조점에 동기화합니다. 포셉을 사용하여 피부를 후퇴시키고 두개골 표면에 있는 브레그마를 국소화합니다. 드릴 비트의 끝을 사용하여 소프트웨어에서 bregma를 참조하고 bregma 위치에서 1 밀리미터 정면과 2 밀리미터 측면으로 드릴을 이동합니다.
두라 마터를 손상시키지 않도록 주의하여 버 구멍을 뚫고 주사기를 버 구멍 위로 이동시하십시오. 주사기에서 0.5에서 1마이크로리터를 분배하여 카테터에 기포가 남지 않도록 합니다. 대류강화 전달을 시작하여 사출 지점에서 유체 역류의 흔적을 두개골 표면을 관찰합니다.
납품및카테터 제거의 끝에서 분당 0.2 마이크로 리터에서 사출 펌프를 시작하여 주입 중에 카테터 막힘의 증거를 확인합니다. 막힘이 발생하지 않으면 사출 혼합물의 액적즉시 카테터 팁에서 나오는 것을 관찰해야합니다. 본 이미지에서 시정판 을 이용한 1마이크로리터의 분당 0.5 마이크로리터를 분당 0.5 마이크로리터로 주입한 후, 바늘관을 따라 역류가 보이지 않는 카테터 단계의 시작 부분에 는 볼 수 없었다.
그리고 분산된 구름은 원하는 구형 모양을 형성했다. 그러나 무딘 끝 바늘을 이용한 이 이미지에서는 상당한 역류가 관찰될 수 있었다. 특히, 대류 강화 전달은 기존의 주입에 비해 균일하고 적은 조직 손상 방식으로 뮤린 뇌에 대량의 관류를 가능하게한다.
두 유형의 전달에서 코퍼스 캘로섬 위에 항체 및 dextran 입자의 전형적인 분포 프로파일이 있다. 그러나, 주입된 항체의 분산 프로파일은 대류 후 고분자량 디엑스트라인에 대해 관찰되는 것보다 더 확산되어 다른 내포물 사이의 분포의 차이를 예시한다. 카테터는 잠재적으로 뇌 주입 하는 동안 막힘 수 있습니다., 천천히 infusate의 작은 볼륨을 분배 하 여 즉시 그것을 확인 하는 것이 중요 하다.
이 절차는 뇌에 약리학적 활성 화합물을 전달하는 방법으로 봉사 할 수 있으며 질병 증상과 예상 부작용의 면밀한 모니터링이 뒤따라야합니다. 이 기술은 항체를 포함하여 치료와 정확한 두뇌 영역의 주입을 가능하게 합니다, 중앙 신경계 표적 치료의 발달을 위한 새로운 가능성을 열어줍니다.
