Este protocolo pode ser usado para realizar a entrega aprimorada de convecção em pequenos roedores usando um sistema de cateter de passo para a perfusão uniforme ajustável de regiões cerebrais alvo. A vantagem da entrega aprimorada da convecção é que permite a entrega de substâncias na região de interesse contornando a barreira hematoencefálica com pouco dano tecidual ou refluxo. Esta técnica é principalmente útil para a entrega de substâncias terapêuticas como anticorpos no cérebro.
E, portanto, pode ser usado para atingir muitas condições neurológicas. Demonstrando o procedimento será Michal Beffinger, um pós-doutor do meu laboratório. Comece cortando um pedaço de tubulação capilar de sílica fundida com um diâmetro interno de 0,1 milímetro e uma espessura de parede de 0,325 milímetros a um comprimento de 30 milímetros.
Depois de examinar a tubulação para rachaduras use um microforge para aquecer o polimento das extremidades para garantir que as aberturas de tubulação tenham uma superfície lisa. Em seguida, monte uma agulha de calibre 27 em uma seringa de 10 micro litros e coloque a seringa em um robô estereotático. Use o robô para mover a seringa sobre uma superfície dura e tocar a superfície com a ponta da agulha.
Depois de notar esta posição elevar a agulha para permitir a colocação da capilar de sílica fundida dentro da agulha de tal forma que 20 milímetros dos salientes capilares da agulha. Use uma pipeta para espalhar uniformemente dois microliters de alta viscosidade cianoacrilato adesivo sobre o capilar a partir da agulha metálica e acabamento dez milímetros acima da extremidade inferior do capilar. Use o robô estereotático para baixar a agulha metálica até que a ponta da agulha esteja um milímetro acima da superfície de referência para fixar o capilar de sílica fundido na agulha metálica formando um passo de um milímetro da ponta da agulha metálica.
Remova qualquer excesso de cola se formando na extremidade da agulha metálica para evitar o plantio da etapa do cateter. Verifique a ponta sob um microscópio para confirmar se todo o excesso de cola foi removido. Em seguida, espere 15 minutos para que a cola endureça e remova a seringa com o cateter do robô.
Para o teste do cateter de passo, o corte solidificou 0,6% de gel de agarose em blocos de 20 por 20 milímetros e preenche manualmente a seringa do cateter de passo com 10 microliters de solução azul filtrada de 0,4%. Usando o robô estereotático, dispense um microliter de corante a 0,2 micro litros por minuto para avaliar a vedação da etapa do cateter durante o procedimento de fixação. A solução azul trypan deve ser visível apenas na ponta do cateter.
Limpe o corante com um tecido de papel e coloque um bloco de agarose no robô estereotático. Calibrar o robô disse que a ponta do cateter é referenciada contra a superfície do bloco de agarose. Defina uma sequência de proporção de volumes de injeção de acordo com o plano experimental específico.
Para injetar a solução no putamen murine caudate, ajuste a injeção em um milímetro frontal e um milímetro lateral a dois milímetros da posição bregma a uma profundidade de 3,5 milímetros. Quando a agulha estiver em posição inicie o procedimento de entrega aprimorada da convecção e injete cinco microliters de solução azul trypan no bloco de agarose. Avalie a forma da nuvem azul trypan na ágarose e para possíveis vazamentos ao longo do trato do cateter.
Nenhum grande fluxo sobre a ponta da agulha metálica deve ser visível. Após a injeção deixe o cateter no lugar por dois minutos antes de retrair a agulha a um milímetro por minuto para garantir uma dispersão adequada do fluido no cérebro e vedação do trato de injeção durante a remoção. Coloque um novo bloco de agarose no robô e inicie uma segunda injeção de um microliter a 0,2 micro litros por minuto para avaliar o entupimento do cateter dentro da ágarose.
O tripano azul deve formar novamente uma nuvem a partir da ponta do cateter imediatamente após o início da injeção. Em seguida, avalie se o volume restante na seringa corresponde a 3 microliters, pois qualquer variação pode indicar um vazamento de fluido através da montagem do cateter ou do êmbolo da seringa. Para a injeção de anticorpos no estriado murina confirme a falta de resposta ao beliscão da pele em um rato anestesiado e raspe a cabeça com um aparador de cabelo.
Desinfete a pele com cotonetes de algodão encharcados em solução de iodo. Use um bisturi para fazer uma incisão de pele de 10 milímetros ao longo do acabamento da linha média craniana ao nível dos olhos. Fixar o mouse na estrutura estereotática usando o grampo do nariz e as barras de ouvido, tomando cuidado para que a superfície do crânio esteja horizontal e bem fixada.
Coloque a seringa no robô estereotático e sincronize a broca com a ponta do cateter em um ponto de referência. Use fórceps para retrair a pele e localizar a bregma na superfície do crânio. Referência bregma no software usando a ponta da broca e mova a broca para um milímetro frontal e duas milímetros lateral da posição bregma.
Faça um orifício de rebarba tomando cuidado para não danificar a dura-secar e mova a seringa sobre o orifício da rebarba. Dispense 0,5 a um microliter da seringa para garantir que não restem bolhas de ar no cateter. Inicie a convecção aprimorada da entrega como demonstrado, observando a superfície do crânio para quaisquer vestígios de fluxo de líquido do ponto de injeção.
No final da entrega e remoção do cateter inicie a bomba de injeção a 0,2 micro litros por minuto para verificar se há evidências de entupimento do cateter durante a injeção. Se não ocorreu entupimento, deve-se observar imediatamente uma gota de mistura de injeção proveniente da ponta do cateter. Nesta imagem de uma nuvem de azul trypan formando após a injeção de um microliter de corante a 0,5 micro litros por minuto usando um cateter aprimorado de convecção como demonstrado, nenhum refluxo ao longo do trato da agulha foi visível durante o início da etapa do cateter.
E a nuvem dispersa formou uma forma esférica desejada. Nesta imagem, no entanto, foi observado um refluxo significativo. Notavelmente, a entrega aprimorada de convecção permite a perfusão de grandes volumes no cérebro murino de forma uniforme e menos prejudicial ao tecido em comparação com a injeção convencional.
Em ambos os tipos de entrega há um perfil típico de distribuição de partículas de anticorpos e dextran sobre o corpo caloso. No entanto, o perfil de dispersão do anticorpo injetado é mais difundido do que é observado para o dextran de alto peso molecular após a distribuição aprimorada da convecção, exemplificando diferenças na distribuição entre diferentes infundidos. Como o cateter pode potencialmente entupir durante a infusão cerebral, é importante verificar imediatamente depois, distribuindo lentamente um pequeno volume de infusão.
Este procedimento pode servir como uma forma de fornecer compostos farmacologicamente ativos ao cérebro e deve ser seguido por um monitoramento próximo dos sintomas da doença e efeitos colaterais esperados. Essa técnica permite a infusão de uma região cerebral precisa com terapêutica, incluindo anticorpos, abrindo novas possibilidades para o desenvolvimento de terapias direcionadas ao sistema nervoso central.
