Bu protokol, hedef beyin bölgelerinin ayarlanabilir tek tip perfüzyonu için bir adım kateter sistemi kullanarak küçük kemirgenlerde konveksiyonla geliştirilmiş teslimatı gerçekleştirmek için kullanılabilir. Konveksiyon la geliştirilmiş doğumun avantajı, çok az doku hasarı veya reflü ile kan-beyin bariyerini atlayarak ilgi bölgesine maddelerin teslimine izin verilmesidir. Bu teknik öncelikle beyne antikorlar gibi terapötik maddelerin teslimi için yararlıdır.
Ve bu nedenle birçok nörolojik koşulları hedeflemek için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Michal Beffinger, benim laboratuvar bir post-doc olacaktır. 0.1 milimetre iç çapı ve 30 milimetre uzunluğunda 0.325 milimetre lik bir duvar kalınlığı ile erimiş silika kılcal boru bir parça keserek başlayın.
Çatlaklar için boru inceledikten sonra boru açıklıkları pürüzsüz bir yüzeye sahip olduğundan emin olmak için uçları parlatmak için bir mikroforge kullanın. Daha sonra, 10 mikro litrelik şırınganın üzerine 27 kalibrelik bir iğne yerleştirin ve şırıngayı stereotaktik bir robota yerleştirin. Sert bir yüzey üzerinde şırınga taşımak ve iğne ucu ile yüzeye dokunmak için robot kullanın.
Bu pozisyonda nettikten sonra iğnenin içine erimiş silika kılcal damarlarının yerleştirilmesini sağlamak için iğneyi yükseltin ve böylece 20 milimetrelik kılcal damar çıkıntısı iğneden çıkar. Metal iğneden başlayarak ve kapiller alt ucundan on milimetre yukarıda bitirme kılcal üzerinde yüksek viskozite siyanoakrilat yapıştırıcı iki mikrolitre eşit yaymak için bir pipet kullanın. İğneucu referans yüzeyinin üzerinde bir milimetre metal iğne ucundan bir milimetre lik metal iğne ucundan bir milimetre adım oluşturan metal iğne erimiş silika kılcal düzeltmek için metal iğne düşürmek için stereotaktik robot kullanın.
Kateter adımEkim önlemek için metal iğne sonunda oluşan herhangi bir fazla tutkal çıkarın. Tüm fazla tutkal kaldırıldı onaylamak için bir mikroskop altında ucu kontrol edin. Daha sonra yapıştırıcının sertlemesini ve kateterle şırıngayı robottan çıkarması için 15 dakika bekleyin.
Adım kateter testi için katılaşmış %0.6 agarose jel 20 milimetrelik bloklara bölünve adım kateter şırıngasını 10 mikrolitre filtrelenmiş 0,4 trippan mavi solüsyonu ile manuel olarak doldurun. Stereotaktik robotu kullanarak, fiksasyon işlemi sırasında kateterin basamağa sızdırmazlığı değerlendirmek için dakikada 0,2 mikro litre lik bir mikrolitre boya dağıtın. Trypan mavi çözeltisi sadece kateterin ucunda görülmelidir.
Boyayı kağıt mendille silin ve stereotaktik robota bir agarose bloğu yerleştirin. Robotu kalibre edin kateterin ucunun agarose bloğunyüzeyine atıfta bulunuldığını söyledi. Enjeksiyon hacimlerinin orantılı dizisini belirli deneysel plana göre ayarlayın.
Murine kaudate putamen içine çözelti enjekte etmek için, 3.5 milimetre derinlikte bregma konumundan bir milimetre frontal ve bir buçuk-iki milimetre lateral enjeksiyon ayarlayın. İğne pozisyonda yken konveksiyon geliştirilmiş teslimat prosedürüne başlayın ve agarose bloğuna beş mikrolitre trippan mavisi çözelti enjekte edin. Agarose'daki trypan mavi bulutunun şeklini ve kateter yolu boyunca olası sızıntıları değerlendirin.
Metal iğnenin ucu üzerinde büyük bir geri akış görünmemelidir. Enjeksiyondan sonra kateteri dakikada bir milimetre geri çekmeden önce kateteri iki dakika yerinde bırakın ve sıvının beyne doğru bir şekilde dağılmasını ve çıkarma sırasında enjeksiyon yollarının sızdırmazlık etmesini sağlayın. Robotun içine yeni bir agarose bloğu yerleştirin ve agarose içinde kateter tıkanmasını değerlendirmek için dakikada 0,2 mikro litre bir mikrolitre ikinci bir enjeksiyon başlatmak.
Trippan mavisi, enjeksiyon başladıktan hemen sonra kateterin ucundan tekrar bir bulut oluşturmalıdır. Daha sonra şırıngadaki artık hacmin 3 mikrolitreye karşılık gelip gelmediğini değerlendirin, çünkü herhangi bir varyasyon kateter montajı veya şırınga pistonu aracılığıyla sıvı sızıntısına işaret edebilir. Murine striatum içine antikor enjeksiyonu için bir anestezi Fare deri çimdik yanıt eksikliği onaylamak ve bir saç düzeltici ile baş tıraş.
İyot çözeltisi ile ıslatılmış pamuklu bezler ile cildi dezenfekte edin. Göz seviyesinde bitirme kranial orta hat boyunca 10 milimetrelik deri kesi yapmak için bir neşter kullanın. Burun kelepçesi ve kulak çubuklarını kullanarak stereotaktik çerçevedeki fareyi düzeltin ve kafatası yüzeyinin yatay ve sıkıca sabitlenmiş olduğuna dikkat edin.
Şırıngayı stereotaktik robota yerleştirin ve matkap ucunu kateterin ucuyla bir referans noktasına senkronize edin. Deriyi geri çekmek ve kafatası yüzeyinde bregma lokalize etmek için forceps kullanın. Matkap ucu nu kullanarak yazılım referans bregma ve bregma konumundan bir milimetre frontal ve iki milimetre lateral matkap taşıyın.
Dura mater zarar ve çapak deliğinden şırınga taşımak için dikkat eden bir çapak delik matkap. Kateterde hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için şırıngadan 0,5 ila bir mikrolitre dağıtın. Konveksiyon geliştirilmiş teslimat başlatın gösterildiği gibi, enjeksiyon noktadan sıvı geri akışı herhangi bir iz için kafatası yüzeyini gözlemleyerek.
Teslimat ve kateter çıkarılması sonunda enjeksiyon sırasında kateter tıkanma kanıt olup yok etmek için dakikada 0,2 mikro litre enjeksiyon pompası başlatın. Tıkanma meydana gelmiyorsa kateter ucundan gelen enjeksiyon karışımının hemen gözlendiği gözlenmelidir. Bir mikrolitre boyanın dakikada 0,5 mikro litre olarak enjeksiyonundan sonra oluşan trippan mavisi bulutunun bu görüntüsünde, konveksiyon gelişmiş kateter kullanılarak, kateter basamanın başlangıcında iğne yolu boyunca reflü görülmüyordu.
Ve dağınık bulut istenilen küresel şekli oluşturdu. Bu resimde künt bir uç iğnesi kullanılarak önemli reflü görülebilir. Özellikle, konveksiyon geliştirilmiş teslimat geleneksel enjeksiyon ile karşılaştırıldığında bir üniforma ve daha az doku zarar şekilde murine beyne büyük hacimlerde perfüzyon sağlar.
Her iki teslim türünde de korpus callosum üzerinde antikor ve dekstran parçacıkların tipik bir dağılım profili vardır. Ancak, enjekte edilen antikor dağılım profili konveksiyon gelişmiş doğum sonrası yüksek molekül ağırlıklı dextran için gözlenenden daha dağınık, farklı infusates arasındaki dağılım farklılıkları örnek. Kateter potansiyel beyin infüzyonu sırasında tıkanıklık gibi, yavaş yavaş infusate küçük bir hacim dağıtarak hemen sonra kontrol etmek önemlidir.
Bu prosedür beyne farmakolojik olarak aktif bileşikler sunmak için bir yol olarak hizmet verebilir ve hastalık belirtileri ve beklenen yan etkileri yakından izlenmesi takip edilmelidir. Bu teknik, antikorlar da dahil olmak üzere terapötik ile hassas bir beyin bölgesiin infüzyon sağlar, merkezi sinir sistemi hedefli tedavilerin gelişimi için yeni olanaklar açılması.
