El método de grabación óptica con tinte sensible al voltaje se cree que es una tecnología ideal para visualizar cómo funciona el cerebro. Este método nos permitió registrar una dinámica neuropsíquica de forma estable y confiable durante 12 horas, nos dio una visión sobre la actividad psíquica. Estamos tratando de ampliar la aplicación para detectar los cambios de circuito causados por los productos químicos en todas las etapas de desarrollo, como la aplicación de ácido valioso a las madres.
La técnica ya está bien establecida. Por favor, intente reproducir los estudios siguiendo el método presentado aquí. Para iniciar este procedimiento, sumerja la cabeza decapitada en ACSF helada en una bandeja quirúrgica de acero inoxidable.
Extraiga el cerebro en un minuto y colóquelo en un vaso de precipitados que contenga ACSF refrigerado durante cinco minutos. A continuación, divide la sección cerebral en la línea media con un bisturí y coloca ambos hemisferios en un bloque de 4%agar. Luego, coloca el bloqueo cerebral con ambos hemisferios en un bloque de 4% de agar.
Limpie el exceso de ACSF del bloque con un papel de filtro. Posteriormente, aplicar superpegamento a la plataforma del vibratome. Coloque el bloque de agar sobre él y limpie el adhesivo excesivo con un papel de filtro.
Aplicar suavemente una pequeña cantidad de hielo frío ACSF desde la parte superior del bloque de agar cerebral para ayudar a solidificar el exceso de superpegamento y evitar que el pegamento cubra el cerebro y moleste el corte. Después, fije la plataforma a la bandeja vibratoria y vierta el ACSF modificado. Ajuste el vibratome a una velocidad lenta y tenga la frecuencia de la hoja en su ajuste máximo.
Entonces empieza a cortar. Coloque los rodajas en la esquina de la cámara de corte en secuencia para que el orden de las rebanadas se pueda distinguir fácilmente. Por lo general, se pueden obtener de tres a cinco rebanadas de un hemisferio.
A continuación, corte la porción del tallo cerebral con una aguja de calibre 30. Con un pequeño pincel con punta, coloque la rebanada en el filtro de membrana sostenido con un anillo de plexiglás. Coloque el anillo en una cámara de recuperación húmeda y asegure la cubierta para mantener la presión interna alta.
Al colocar la rebanada en el filtro de membrana, ajuste la dirección y la posición de la rebanada dentro del anillo para asegurarse de que está bien centrada y tiene una dirección consistente. Deje el espécimen a 28 grados centígrados durante 30 minutos y luego a temperatura ambiente durante al menos 10 a 30 minutos para su recuperación. Para manchar las rodajas, aplique suavemente 100 microlitros de la solución de tinción sobre cada rodaja e incubar a 20 minutos para la temperatura ambiente.
A continuación, prepare de 50 a 100 mililitros de ACSF en un recipiente. Coloque el anillo con la muestra para enjuagar la solución de tinción. Luego, transfiera las rodajas enjuagadas a otra cámara de incubación.
Espere más de una hora para la recuperación antes del experimento. Para comenzar este procedimiento, encienda el amplificador, el ordenador y el sistema de cámara y abra el software. Vierta ACSF en un tubo de 50 mililitros y burbujee con carbógeno.
Utilice una bomba peristáltica para hacer circular el ACSF y ajustar el caudal a aproximadamente un mililitro por minuto. A continuación, ajuste la altura de la pipeta de aspiración para que el nivel de líquido dentro de la cámara del experimento sea siempre constante. Coloque el electrodo de tierra en la cámara.
Posteriormente, llene el electrodo de vidrio con una pequeña cantidad de ACSF y colóquelo en el soporte del electrodo. Fije el soporte a la varilla del manipulador. Usando un amplificador, asegúrese de que la resistencia del electrodo es de aproximadamente un megaohm.
En la sesión de grabación, transfiera una rebanada de la cámara húmeda a una cámara experimental. Presione firmemente el borde del anillo en la junta tórica de silicona. Tenga cuidado de no romper la membrana o la parte inferior de la cámara del experimento.
Bajo el microscopio coloque la punta del electrodo estimulante y el electrodo de grabación potencial de campo en la rebanada. Compruebe la respuesta evocada mediante la entrega de un estímulo. Confirme que el campo de visión cubre el circuito neural correcto en el sistema de grabación óptica.
A continuación, ajuste la intensidad de la luz de excitación a aproximadamente 70 a 80% de la capacidad máxima en la cámara. Con la fuente de luz fluorescente, ajuste el enfoque con el sistema de adquisición. A continuación, inicie la grabación y analice los datos en un software de adquisición de imágenes después de la adquisición.
Esta figura muestra la señal óptica representativa sobre la estimulación eléctrica del Schaffer collaterol en el área CA1 de una rebanada de hipocampo de ratón. Estas imágenes consecutivas muestran la señal óptica antes de que se aplicaran filtros espaciales y temporales, mientras que estas imágenes muestran los mismos datos después de aplicar un filtro cúbico de cinco por cinco por cinco dos veces. Debido a la alta velocidad de fotogramas y la alta resolución espacial, la aplicación del filtro no cambió la señal, sino que filtró el ruido que también se puede observar en el curso de tiempo registrado en píxeles en una sola prueba.
Aquí está la comparación de las respuestas típicas en el área CA1 de las rebanadas del hipocampo entre el ratón y la rata. La pequeña respuesta hiperpolarizante se observa en el lado distal de la CA1 después de 24 milisegundos en la rebanada del hipocampo del ratón, pero una respuesta hiperpolarizante más masiva superó la respuesta despolarizante en la rebanada del hipocampo de rata. Una vez que las rebanadas están manchadas, deben durar más de 12 horas y puede realizar otras grabaciones electrofisiológicas en ellos.
