Reconocemos el apoyo de la Facultad de Ciencias de la Computación y la Facultad de Ciencias, Agricultura e Ingeniería de la Universidad de Newcastle, por la Universidad de Ulm, y por el SciMedia Ltd (Tokio, Japón).

1. Preparación del cangrejo del Sistema Nervioso Stomatogastric Adultos Cancer pagurus L. fueron obtenidos de fuentes locales (Universidad de Newcastle, Paloma Marina de Laboratorios) y se mantienen en filtrada, el agua de mar aireada (10 - 12 ° C). Los animales fueron anestesiados por el embalaje en hielo durante 20 - 40 min antes de la disección. Hemos utilizado los sistemas aislados stomatogastric nervioso (STNS) 1. El STNS fue precisado en un elastómero de silicona forrada (ELASTOSIL RT-601, Wacker, Munich, Alemania), placa de Petri y superfused continua (7 - 12 ml / min) con solución salina fría (10-13 ° C). Solución salina fisiológica consistió en (mmol * l-1): NaCl, 440; MgCl 2, 26; CaCl 2, 13; KCl, 11; trisma base, 10; ácido maleico, 5. Solución salina se mantiene a una temperatura constante de 11 a 13 ° C y un pH de 7,4 a 7,6. Los pasos detallados de la disección STNS y preparación, incluyendo el desheathing del ganglio stomatoastric (STG), se presentan en el artículo JoVe por Gutiérrez y Grashow 1. Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva Europea del Consejo de Comunidades º 24 de noviembre 1986 (86/609/CEE). La figura 1A muestra un diagrama esquemático de la STNS y Figura 1B muestra una típica STG desheathed que sus neuronas dispuestas en un semicírculo plana en la parte posterior del ganglio. La placa de Petri con la STNS se fija a la plataforma operativa del microscopio de imagen (BW51 WI, Olympus, Tokio, Japón) con plastilina. Tanto, la platina del microscopio, el microscopio se montan sobre una mesa de vibración aislada (Scientifica, Uckfield, Reino Unido) para evitar que los artefactos movimiento durante la grabación óptica. Los patrones motores generados en el ganglio stomatogastric (STG) se determinan con grabaciones extracelular 2-4. Esto se hace a través de los siguientes pasos: <ol><li> Un compartimiento de vaselina basado cilíndrico está construido alrededor de una sección del nervio motor principal (LVN) para aislar eléctricamente el nervio del baño (esto se hace en el escenario antes de la disección de la placa de Petri se coloca en la plataforma de funcionamiento del microscopio de imagen ). </li><li> Uno de los dos alambres de acero inoxidable electrodo se coloca en este compartimiento, y el otro en el baño como un electrodo de referencia. </li><li> La señal diferencial se registra, se filtra y amplifica con un amplificador diferencial AC (Universidad de Kaiserslautern, Alemania). </li><li> La actividad motora del ganglio se controla mediante un osciloscopio (DL708E, Yokogawa, Tokio, Japón) y es, además, grabado con una tarjeta de adquisición de datos (Power CED, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido) y la Espiga de 2 v6.10 software (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Los archivos son analizados mediante el de Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). </li></ol> 2. Preparación de la solución de colorante Se utilizaron los fluorescentes sensibles al voltaje tinte Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience) 5, que tiene una doble carga positiva que facilita la carga de la tinta a través de microelectrodos positivos mediante el uso de pulsos de corriente. La solución de colorante debe ser protegido de la luz tanto como sea posible. La solución colorante se prepara de la siguiente manera: <ol><li> 5 mg de tintura se mezcla con 1 ml de ácido Pluronic F-127 en DMSO (Invitrogen) solución. </li><li> El vial de plástico que contienen el colorante disuelto se centrifuga durante 20 minutos a 12.000 rotaciones / minuto en una microcentrífuga 01.14 Sigma (Sigma, Osterode, Alemania) para separar las partículas más grandes tintes que pueden obstruir los microelectrodos. </li><li> El sobrenadante (top 200 l) de la solución de colorante se separa mediante una pipeta y se almacena en un frasco de plástico por separado. Ambos viales se envuelven en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. </li><li> La solución colorante se congela a -20 ° C. </li><li> Antes de utilizar la solución de colorante que se derrita, colocando el frasco cerrado y envuelto en agua tibia (25 ° C) durante 10-15 minutos. </li></ol> 3. Colorante de carga por inyección intracelular con microelectrodos de Sharp Hemos utilizado microelectrodos fuerte para cargar las neuronas con el tinte. Para comprobar la carga de tintes que utilizamos el sistema de imágenes MiCAM02 (SciMedia, Tokio, Japón) 6. El sistema de imágenes cuenta con dos cámaras CCD: la cámara de recursos humanos tiene un chip sensor de mayor tamaño (6,4 mm x 4,8 mm) proporciona una mejor resolución espacial con la mejor resolución temporal que 1,4 ms, la cámara del SA, tiene un menor (2,9 mm x 2,1 mm), pero más rápido chip sensor que permite más rápido de imágenes que tengan 0,7 ms como su mejor resolución temporal. Los pasos de la carga de tintes son los siguientes: <ol><li> Microelectrodos se tira con un P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, EE.UU.), extractor de electrodo con 10 cm de largo, 1 mm de diámetro exterior de los tubos de vidrio de filamento (GB100TF 8P, Science Products, Hofheim, Alemania). Los electrodos se retiró para tener una resistencia en elrango de 25 a 40 MOhm en KCl 3M (para tirar adecuada configuración de los parámetros siguen el libro de cocina pipeta provista por el fabricante del extractor de electrodos). </li><li> La solución de colorante congelado es fundido y una cantidad muy pequeña de la que es absorbida en una aguja Microfil (Microfil - 34G, Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL, EE.UU.) - el colorante absorbido llena alrededor de RD 2 / 3 de la aguja Microfil . </li><li> La solución de colorante en la aguja Microfil se inyecta en la punta de un microelectrodo. El micro se coloca en una caja oscura durante 15 minutos. </li><li> El micro se rellena con solución de KCl 3M. El electrodo se coloca de nuevo en una caja de almacenamiento de electrodo oscuro para otros 10-20 minutos para permitir que la solución de colorante para llegar a la fina punta del electrodo por la succión de la fuerza capilar que en el microelectrodo. </li><li> El micro listo se coloca en un porta-electrodo y se fija en el headstage del amplificador intracelular (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, EE.UU.). </li><li> El amplificador intracelular está conectado a la tarjeta de adquisición de datos que proporciona una señal de pulso para conducir impulsos de corriente en el microelectrodo. </li><li> El micro se coloca suavemente en la membrana de una neurona STG utilizando un manipulador de microelectrodos (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, Reino Unido). Desde la distancia de trabajo de los objetivo de 10x (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 mm, Olympus Corporation, Tokio, Japón) del microscopio de imagen es muy pequeña, el microelectrodo se debe colocar en posición oblicua (alrededor de 30 °) y el movimiento de los microelectrodos en la posición correcta requiere de varios pasos de la reorientación de los objetivos del microscopio y el movimiento de microelectrodos. Para iniciar el microelectrodo se mueve en una posición tal que la punta está por encima del STG. El objetivo del microscopio se baja hasta que la punta del electrodo aparece en foco. Luego de que se baje aún más, pero no tanto para tocar el microelectrodo. El micro se baja hasta que vuelva a aparecer en el foco del objetivo. Estos pasos se repiten hasta que las neuronas aparecen claramente en el plano de enfoque del objetivo. A continuación, el microelectrodo se baja hasta que toque suavemente y penetra en la membrana de la neurona STG seleccionado. Este control se ejerce mediante el osciloscopio. </li><li> El electrodo intracelular se utiliza para registrar la actividad de la neurona STG seleccionados con el fin de identificar las neuronas debido a su perfil de actividad y la relación entre su actividad y la actividad STG registrado desde el electrodo extracelular 2,3,7. </li><li> El amplificador intracelular pasa a modo de inyección de corriente y se utiliza durante 30 minutos para inyectar 10 nA pasos positivos actuales en el microelectrodo que duran un segundo y están separados por un segundo vacíos sin corriente inyectada en el microelectrodo. Las unidades de la corriente inyectada moléculas cargadas positivamente medio de contraste en las neuronas registradas. Si se dispone de equipos múltiples neuronas puede ser inyectado al mismo tiempo. </li><li> Diez minutos en el período de inyección y después de la final de la inyección de la propagación de tinte dentro de la neurona está activada. Para ello se utiliza el sistema MiCAM02 imágenes (SciMedia Ltd, Tokio, Japón) con el objetivo de 10x e iluminación de la fuente de luz ultra-baja ondulación halógenas (HL-151; Moritex, Tokio, Japón) a través de la MSWG2 cubo de filtro (con 480-550 nm de excitación filtro, Olympus Corporation, Tokio, Japón). El sistema de imagen está configurado para usar la cámara de recursos humanos con 192 píxeles de resolución x 128, 40 ms de tiempo de imágenes, el modo de &quot;hbin &#39;, y 10 cuadros por sesión de imágenes. Si el relleno colorante es el éxito de la imagen debe mostrar un parche coloreado en la neurona torno a la ubicación de los microelectrodos, y este parche teñido debe crecer entre las imágenes tomadas después de 10 minutos y después de 30 minutos. Si la difusión del colorante es insuficiente después de 30 minutos, más tiempo de inyección se concede. Por otra parte, un electrodo nuevo colorante puede ser utilizado. </li><li> El electrodo se sacó de la neurona y la neurona se deja descansar por lo menos 20-30 minutos. Dentro de este tiempo, la siguiente neurona puede ser inyectado con tinta. </li></ol> 4. Imágenes de las neuronas teñidas La actividad de las neuronas individuales se pueden crear imágenes después de que el procedimiento de tintura de llenado. Por otra parte dos o más neuronas puede ser llenado con la imagen de la actividad simultánea de las neuronas STG varios. En principio muchas y posiblemente todas las neuronas STG puede ser llenado con medio de contraste. Las imágenes de las neuronas se hace con el 02 Micam sistema de imágenes con la cámara de recursos humanos. El procedimiento de la imagen es la siguiente: <ol><li> El objetivo del microscopio se cambia y una transmisión de luz de alta eficiencia objetivo 20x (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0,95, WD de 2,0 mm, Olympus Corporation, Tokio, Japón) se utiliza para la recolección de datos de imágenes. Este objetivo se acumula mucha más luz que el objetivo de 10x y también le da un mayor aumento, proporcionando una imagen más detallada de las neuronas. Bein<html> g eficiente significa más luz que una pequeña cantidad de colorante de carga ya es visible con este objetivo y que podemos utilizar una menor intensidad de la luz de la imagen reduciendo el daño potencial de fotos que pueden ser causados ​​a las neuronas por el tinte. </li><li> Etapa del microscopio operativo se coloca de tal manera que las neuronas que están destinados a ser reflejado en el campo de visión del objetivo y el objetivo se centra en ellos. </li><li> Los datos de registro extracelular también se introduce en el sistema de imágenes de Micam 02 a través de su canal de entrada analógica. Esto permite que la relación relativamente fácil de las señales ópticas y los patrones correspondientes de motor o picos extracelularmente registradas en la fase de análisis. </li><li> El sistema de Micam 02 está configurado para utilizar 96 x 64 píxeles de resolución con 2,2 ms de tiempo de imágenes o 48 x 32 píxeles de resolución con 1,5 ms de tiempo de imágenes. En ambos casos el &quot;hbin &#39;ajuste se puede utilizar si el teñido de las neuronas no es muy fuerte. </li><li> El nivel de luz se ajusta lo más bajo posible (es decir, el medio de contraste en las neuronas que generan fluorescencia todavía suficiente para que la imagen) para evitar la foto de la modulación y la foto daño de las neuronas registradas. </li><li> La iluminación de la habitación y todas las fuentes de luz que queda se apaga. Además, un telón negro se puede cerrar todo el equipo de grabación para evitar exposición a la luz de fuentes externas. </li><li> Las sesiones de formación de imágenes se fijan para ser entre 4 a 16 segundos de duración. </li><li> La actividad espontánea de las neuronas teñidas se registra durante las sesiones de imágenes varias. </li></ol> 5. El análisis de los datos de imagen óptico Para analizar los datos de imagen se utilizó el software BVAna (versión 10.08; SciMedia Ltd, Tokio, Japón) asociados con la MICAM 02 sistema de imágenes. El software es compatible con la visualización de los datos de imagen y ofrece una amplia gama de herramientas de análisis. Los pasos del análisis e interpretación de datos son los siguientes: <ol><li> En la región apropiada circular de interés se selecciona en cada neuronas registradas. Normalmente se utiliza 2-3 regiones radio de píxeles de interés para la investigación de las neuronas en la resolución de 48 x 32 píxeles, y 6 - 8 regiones radio de píxeles de interés para la investigación de las neuronas en la resolución de 96 x 64. </li><li> La suavización temporal de los datos puede ser necesaria, especialmente si el medio de contraste genera cantidad relativamente baja de fluorescencia (valor de fondo de baja en los datos indica que esto, puede ser debido a la baja el nivel de luz que se utiliza o carga de bajo nivel medio de contraste, por ejemplo en las neuritas de las neuronas registradas). Normalmente en estos casos se utilizó el suavizado temporal de 3 a 5 unidades de tiempo. </li><li> Además de las grabaciones ópticas también mostrar el registro extracelular de la selección para mostrar la entrada analógica del sistema de imagen. </li><li> Los parámetros para la visualización de los datos ópticos y de la entrada analógica debe ser un valor apropiado para poder ver todas las grabaciones en la pantalla del ordenador. </li><li> Teniendo en cuenta las grabaciones ópticas de las neuronas, el registro extracelular de la LVN, y la clasificación de la neurona sobre la base de la grabación antes intracelular, es posible determinar la identidad de la neurona y relacionar su actividad con las actividades neuronales grabados de la los nervios. </li><li> Se espera que las grabaciones ópticas muestran claramente, y sin la necesidad de un promedio de más de varios eventos similares, las actividades neuronales que corresponden a los picos registrados extracelularmente y eventos subumbral como inhibidores potenciales postsinápticos causados ​​por la actividad de otras neuronas. </li><li> Las funciones de exportación de datos del software BVAna se puede utilizar para exportar las grabaciones ópticas calculadas para las regiones seleccionadas de interés y también la entrada analógica que contiene la grabación de la LVN. La exportación de datos pueden ser procesados ​​y analizados posteriormente con otros programas de análisis de datos, así (por ejemplo, en el caso más simple de Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE.UU.) se puede utilizar para la visualización y procesamiento de datos adicionales). </li></ol> 6. Resultados representante La figura 2 muestra la grabación simultánea de dos neuronas (LP, lateral neurona pilórica, PD, pilórica dilatador neuronas) en el generador de patrones pilórica central de un cangrejo STG junto con la grabación de la LVN. Las grabaciones ópticas de las neuronas LP y EP identificados sobre la base de sus registros intracelulares muestran que, efectivamente, estos corresponden bien con las grabaciones correspondientes a las neuronas extracelular LP y EP. Hay un constante retraso de 12 ms entre las grabaciones ópticas y LVN de los picos de alza (ver recuadro de la Figura 2) debido a la demora en la transmisión axonal entre el ganglio y el sitio de registro extracelular. Los datos presentados también muestran que la actividad neuronal en el soma que corresponde a los picos de las neuronas registradas es claramente detectable. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Un diagrama) Esquema del sistema nervioso stomatogastric (STNS). COG, el ganglio comisural, OG, ganglionares del esófago, STG, el ganglio stomatogastric, STN, los nervios stomatogastric; LVN, los nervios del ventrículo lateral. B) El ganglio cangrejo stomatogastric (STG) - La imagen muestra la disposición semicircular posterior de las neuronas STG. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Grabación simultánea de un solo barrido de un EP y un LP de neuronas junto con la grabación de la LVN. Los datos muestran que que las grabaciones ópticas y de los nervios partido muy bien y que podemos identificar las actividades neuronales que corresponden a los picos registrados forman el nervio. El recuadro muestra una superposición de varios barridos de potenciales de acción LP - tanto óptica y eléctrica registrado - y su promedio de demostrar la correspondencia entre las actividades de óptica y eléctrica registrado. Debido al hecho de que nuestro método de grabación óptica no filtra los componentes de baja frecuencia de los datos que también son capaces de registrar cambios lentos potencial de membrana característica de la EP y LP neuronas 14.

<ol>
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El medio de contraste de imagen sensibles al voltaje de 8,9 STG las neuronas, en combinación con los métodos tradicionales de electrofisiología (grabaciones de electrodos intra y extracelular) permite una mejor comprensión de cómo funciona este pequeño, nervioso conocido y complejo aún el sistema. La STG es un prototipo de generador de patrones centrales (GPC) de las redes neuronales (que incluye las redes de planta de píloro gástrico y el ritmo), 10, 11, por lo tanto una mejor comprensión de las propiedades emergentes funcional de la STG también ayudará a entender cómo, en general, CPG generar redes de su funcionalidad a nivel de red. CPG redes juegan un papel crítico en el control motor 12 y también en las funciones cognitivas superiores 13, por lo tanto una mejor comprensión de sus propiedades emergentes pueden tener un gran impacto en muchas áreas de las neurociencias.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MiCAM02</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia Ltd, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>BVAna v.10.08</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia, Tokyo, Japab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>HL-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Moritex, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra-low ripple halogen light source</td>
</tr>
<tr>
<td>BX51 WI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upright microscope for epifluorescence imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>20x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>XLUMPLFL20XW/0.95</td>
<td>NA 0.95, WD 2.0mm</td>
</tr>
<tr>
<td>10x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>UMPLFL10XW</td>
<td>NA 0.30, WD 3.3mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>MSWG2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antivibration table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>63-534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PatchStar electrode manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>PS-7000C</td>
<td>Micro-electrode manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>CED Power 1401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data acquisition board</td>
</tr>
<tr>
<td>DL708E Oscilloscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>AC differential amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University of Kaiserslautern, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>P-97 Flaming &#x2013; Brown type electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrode puller</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma Microcentrifuge 1-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, Osterode, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Centrifuge</td>
</tr>
<tr>
<td>Genex Pipettors Mline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
<td>PIP7774</td>
<td>PIP7774</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass micropipette with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
<td>GB100TF 8P</td>
<td>Glass for microelectrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>MicroFil &#x2013; 34G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microfil needle</td>
</tr>
<tr>
<td>Spike 2 v6.10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrophysiology software</td>
</tr>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Bioscience Ltd, Cambridge, UK</td>
<td>BT61014</td>
<td>Fluorescent voltage sensitive dye</td>
</tr>
<tr>
<td>F-127 Pluronic Acid, DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Paisley, UK</td>
<td>P-3000MP</td>
<td>Solvent</td>
</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>S9888</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2 . 2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>C3881</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>P3911</td>
<td>Crab saline component, electrolyte solution</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2 . 6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M9272</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Trizma base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>T1503</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Maleic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M0375</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Elastosil RT-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wacker, Munich, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lining of Petri dishes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical imaging of neurons in the crab stomatogastric ganglion with voltage-sensitive dyes

Sensibles al voltaje de imágenes tinte de las neuronas es una metodología clave para la comprensión de cómo las redes neuronales se organizan y cómo la actividad simultánea de neuronas que participan conduce a la aparición de la funcionalidad integral de la red. Aquí se presenta la metodología de aplicación de esta técnica a las neuronas generando patrón identificado en el ganglio de cangrejo stomatogastric. Se demuestra la carga de estas neuronas con los fluorescentes sensibles al voltaje tinte Di-8-ANEPPQ y nos muestran cómo la imagen de la actividad de las neuronas tinte cargado con la velocidad MiCAM02 alta y de alta resolución CCD sistema de cámara de imagen. Se demuestra el análisis de los datos de imágenes grabados con el software de imágenes BVAna asociados con el sistema de imágenes MiCAM02. La simultánea de imágenes sensibles al voltaje medio de contraste de la actividad detallada de múltiples neuronas en el ganglio de cangrejo stomatogastric aplicarse junto con las técnicas tradicionales de electrofisiología (registros intracelulares y extracelulares) abre radicalmente nuevas oportunidades para la comprensión del funcionamiento de centrales generador de patrones de las redes neuronales.

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Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Aquí se presenta la metodología para la resolución rápida y de alta fluorescentes sensibles al voltaje de imágenes tinte de la actividad detallada de las neuronas en el ganglio stomatogastric cangrejo.

Imagen óptica de neuronas en el ganglio Cangrejo Stomatogastric con tintes sensibles al voltaje

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

optical-imaging-neurons-crab-stomatogastric-ganglion-with-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.9K vistas.  Ulm University. Aquí se presenta la metodología para la resolución rápida y de alta fluorescentes sensibles al voltaje de imágenes tinte de la actividad detallada de las neuronas en el ganglio stomatogastric cangrejo.

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Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Investigación

Neurociencias

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

Imaging 3-D y Análisis de neuronas infectadas<em&gt; En Vivo</em&gt; Con<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Grabación óptica de campo ancho de un solo fotón en cortes cerebrales con tinte sensible al voltaje

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Aislamiento y cultura de chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...