Este protocolo mide los niveles de ubiquitinación de proteína subcelular y la actividad proteosoma en el cerebro de los roedores, lo que permite comparar dentro de los sujetos cómo cambia la actividad ubiquitina-proteosoma en respuesta a la actividad celular, el aprendizaje o la enfermedad. El protocolo permite la recolección de fracciones sinápticas, citoplasmáticas y nucleares del mismo cerebro de roedores. Minimizando la pérdida, se podría realizar con pequeñas cantidades de tejido y equipos básicos de laboratorio.
Demostrando el procedimiento estará Taylor McFadden, un estudiante graduado de mi laboratorio. Comience este procedimiento con la recolección y disección del tejido cerebral de roedores como se describe en el protocolo de texto. Asegúrese de que el hemisferio utilizado está equilibrado en contra de las condiciones de extracción para cada grupo experimental.
Retire el microtubo centrífugo de 1,5 mililitros que contiene un hemisferio de la región de interés del congelador de menos 80 grados Celsius. Usando un bisturí, transfiera el tejido cerebral congelado a un homogeneizador de teflón de vidrio de dos mililitros. Añadir 500 microlitros de tampón de lelisis al tubo de teflón.
Usando el pestle B, homogeneizar el mismo tejido con 15 golpes hasta que no haya una cantidad visible de material sólido presente. Usa un movimiento de giro durante cada golpe. Con una pipeta de 1.000 microlitros, transfiera la muestra homogeneizada a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Coloque el tubo sobre hielo húmedo e incubar durante 30 minutos. Coloque el tubo en la microcentrífuga y gire durante 10 minutos a 845 veces g en cuatro grados centígrados. Después de la finalización, retire cuidadosamente el sobrenadante pipeteando y colóquelo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Esta es la fracción citoplasma. Añadir 50 microlitros de tampón de extracción al pellet resultante y resuspend por pipeteo. No vórtice el pellet.
Coloque el tubo que contiene el pellet resuspendido sobre hielo e incubar durante 30 minutos. A continuación, centrifugar el tubo durante 20 minutos a 21, 456 veces g en cuatro grados Centígrados. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante pipeteando y colóquelo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Esta es la fracción nuclear. Homogeneizar un hemisferio de la región de interés como antes, excepto para utilizar 500 microlitros de búfer TEVP en lugar de búfer de lelisis. Con una pipeta de 1.000 microlitros, transfiera la muestra homogeneizada a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Centrifugar la muestra a 1.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros utilizando una pipeta de 1.000 microlitro. Centrifugar la muestra a 10.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el pellet original que contiene núcleos y los desechos grandes. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Esta es la fracción citosólica.
Añadir 50 microlitros de tampón de homogeneización al pellet y resuspend por pipeteo hasta que no haya material sólido visible. Centrifugar la muestra a 20.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Esta es la fracción de membrana sinaptosomal bruta. Para configurar el ensayo, precalienta el lector de placas a 37 grados celsius y mantén presionado durante la carrera. Ajuste la excitación a 360 nanómetros y la emisión a 460 nanómetros.
Si la placa de 96 pozos utilizada es clara, ajuste la posición de la óptica a la parte inferior. Si se utiliza una placa oscura de 96 pozos, ajuste la posición de la óptica a la parte superior. Programe una carrera cinética con un tiempo de dos horas de escaneo cada 30 minutos.
Reconstituya el tampón de ensayo 20S 10X suministrado en el kit con 13,5 mililitros de agua ultrapura. Añade 14 microlitros de 100 ATP mililares al búfer ahora 1X. Esto mejora significativamente la actividad proteosoma en las muestras y mejora la fiabilidad del ensayo.
Reconstituya el estándar AMC proporcionado en el kit con 100 microlitros de DMSO. Realice pasos utilizando el estándar AMC en la oscuridad o en condiciones de poca luz, ya que el estándar es sensible a la luz. Cree una curva estándar de AMC a partir de una serie de concentraciones de AMC altas a bajas.
Esta curva se utilizará para la calibración del lector de placas y el análisis de la actividad proteosoma en las muestras homogeneizadas. Reconstituir el subtrato proteoso suministrado en el kit con 65 microlitros de DMSO. También realice este paso en la oscuridad o en condiciones de poca luz, ya que el sustrato es sensible a la luz.
A continuación, cree una dilución de uno a 20 del sustrato proteosoma en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros utilizando el tampón de ensayo 20S. Agregue una cantidad normalizada de las muestras deseadas a una placa de 96 pozos. Ejecute cada muestra por duplicado.
La cantidad de muestra necesaria varía en función de la preparación del tejido. Generalmente, 10 a 20 microgramos es suficiente para cualquier fracción subcelular. Lleve el volumen del pozo de muestra a 80 microlitros con agua ultrapura.
La cantidad agregada depende del volumen de muestra agregada. En dos pozos separados, agregue 80 microlitros de agua solo. Estos serán los espacios en blanco del ensayo.
Agregue 10 microlitros de búfer de ensayo 20S a cada pozo, incluidos los espacios en blanco de ensayo. Utilice un repetidor o una pipeta automatizada para garantizar un volumen de ensayo uniforme en todos los pozos. Apague las luces o entre en una habitación oscura.
Agregue los 100 microlitros de estándares AMC diluidos a un nuevo pozo usando un solo pozo para cada estándar. En la oscuridad, utilice un repetidor o pipeta automatizada para añadir 10 microlitros de sustrato proteosoma diluido a los pozos que contienen en blancos de muestras y ensayos, pero no el estándar AMC. Coloque la placa en el lector de placas e inicie la carrera cinética.
Realizar la cuantificación de diversas etiquetas de poliubiquitina en diferentes fracciones subcelulares recogidas a partir del tejido cerebral de roedores utilizando una variedad de protocolos de hinchazón occidental estándar en combinación con anticuerpos únicos de poliubiquitina específicos de la vinculación. Algunas imágenes de manchas occidentales de ubiquitina proporcionarán columnas de bandas distintas, mientras que otras producen un patrón similar a un frotis con pocas o ninguna línea clara. Para cuantificar las manchas occidentales de ubiquitina con imagen, dibuje una caja alrededor de la columna que extienda toda la escalera de estándares moleculares.
Ajuste la caja si la tinción de ubiquitina se extiende a través de toda la escalera. Esto es común para las modificaciones de lisina 48 y varía ampliamente entre los compartimentos subcelulares. Por último, restar el fondo que se calcula como la densidad óptica media del fondo que rodea inmediatamente la columna en todos los lados.
Aquí se muestra la cuantificación de la actividad proteosoma en diferentes fracciones recogidas de la amígdala lateral del mismo animal. Durante el ensayo de actividad proteosoma in vitro, las unidades fluorescentes relativas detectadas aumentaron desde el principio hasta el final del ensayo en la fracción sináptica, la fracción citoplasmática y la fracción nuclear. El inhibidor del proteasoma beta-lac impidió que las RFU cambiaran a lo largo de la sesión.
Se observaron diferencias subcelulares en la actividad proteosoma en la amígdala lateral del mismo animal. Se detectó un aumento de la actividad proteosoma nuclear en animales entrenados en relación con los controles que correspondían a una disminución de la actividad dentro de la fracción sináptica. La actividad proteosoma citoplasmática se mantuvo al inicio.
Aquí se muestran diferencias subcelulares en la ubiquitinación de proteína específica de la vinculación en la amígdala lateral del mismo animal después del aprendizaje. Hubo un aumento en la ubiquitinación general en la fracción nuclear después del aprendizaje que se correlacionó con una disminución en la fracción citoplasma. Después del aprendizaje, la ubiquitinación lineal aumentó en la fracción nuclear, pero no en las fracciones citoplasmáticas o sinápticas.
Curiosamente, la ubiquitinación K63 aumentó en la fracción nuclear después del aprendizaje que se correlacionó con una disminución en la fracción sináptica. Mientras que la uniquitinación K48 aumentó en las fracciones nucleares y citoplasmáticas después del aprendizaje, pero no en la fracción sináptica. Este protocolo también se puede utilizar para comprender la distribución subcelular y la función de otras proteínas dentro del mismo animal.
