Este protocolo compara la carga de placa beta amiloide en secciones completas de interés y subregiones de interés en secciones cerebrales de ratones transgénicos APP / PS1. El método y los resultados presentados en este protocolo en particular permitirán a los lectores o investigadores elegir entre la región completa de interés o la subregión de análisis de interés para determinar una carga beta en las secciones del cerebro del ratón. Para comenzar, descargue el software de análisis de imágenes.
Tras la instalación, inicie el software y haga clic en el archivo, luego abra y elija la imagen que se analizará. En la barra de herramientas del software, seleccione la herramienta recta y dibuje una línea recta a lo largo de la longitud de la barra de escala. Haga clic en el análisis, luego haga clic en las pestañas de escala establecida.
Nuevamente, haga clic en el análisis, luego mida las pestañas para anotar la longitud o la distancia de la barra de escala en píxeles. En la ventana emergente, ingrese la distancia en píxeles, la distancia conocida de la barra de escala e ingrese la unidad de longitud como un micrómetro. A continuación, marque la casilla global para aplicar la nueva configuración de escala a todas las imágenes siguientes, si se procesan varias imágenes.
Haga clic en Aceptar para aplicar la configuración. Para establecer la medición deseada en el área de la sección, vaya a analizar, luego establezca las mediciones y seleccione el área y muestre los cuadros de etiquetas. Asegúrese de que la imagen que se está analizando está seleccionada en la pestaña Redirigir a.
Para facilitar la visualización del hipocampo o la corteza, vaya a la imagen y ajuste el brillo o el contraste. Arrastre la barra deslizante máxima gradualmente hacia la izquierda para aumentar la claridad del tejido hasta que las regiones cerebrales de interés o ROI sean identificables. Utilice el polígono o la herramienta de selección a mano alzada para delinear la región del hipocampo.
Una vez que se describe la región, haga clic en la opción de restablecimiento de la configuración de brillo o contraste para volver al brillo original. Para medir el área total de tejido de la región seleccionada, haga clic en la edición y borre el exterior. Una vez que la región seleccionada es la única imagen en la pantalla, haga clic en el análisis y, a continuación, mida las pestañas para obtener el área total de tejido analizada en una ventana emergente.
A continuación, guarde los datos en un archivo de Excel. Para medir el área positiva teñida de 6-E10, vaya a las pestañas de imagen, ajuste y umbral de color en orden. Un filtro prefabricado bajo el método de umbral proporciona los resultados deseados destacando las señales más fuertes en rojo.
Después de seleccionar el umbral apropiado, verifique el fondo oscuro para resaltar las manchas beta amiloides en un fondo negro. Haga clic en el seleccionar, luego en el original y vuelva a seleccionar, dando las señales oscuras de los depósitos beta amiloides sobre un fondo blanco. Cuando se genere la ventana emergente, haga clic en la pestaña analizar y analizar partículas y presione Aceptar. Copie la salida de resumen generada por el software haciendo clic en los botones editar y copiar.
Luego, pegue en el archivo de Excel iniciado previamente con las etiquetas respectivas. Calcule el porcentaje de área positiva 6E-10 utilizando la fórmula Después de descargar el software de análisis de imágenes, realice los pasos hasta que el ROI cerebral sea identificable, como se demostró anteriormente. Luego, usando la herramienta de rectángulo, seleccione el ROI en la corteza o el hipocampo.
En la barra de herramientas, haga clic en editar, luego seleccione y especifique la pestaña cambiando la altura y el ancho a un valor predefinido. Ajuste la caja para que esté completamente cubierta por el tejido. Restablezca el brillo o el contraste al brillo original.
Duplique el ROI seleccionado haciendo clic con el botón derecho en el cuadro y haciendo clic en el duplicado. Se abrirá una nueva ventana con la región seleccionada. Cambie el nombre de la imagen duplicada para mostrar la región en la que se encuentra.
Ajuste el tipo de imagen duplicada utilizando la barra de herramientas y haciendo clic en la imagen, luego escriba claves de 8 bits para convertir la imagen RGB duplicada a 8 bits, para analizar mejor las placas. Invierta la imagen haciendo clic en editar y, a continuación, invierta. Para medir el área positiva 6E-10, vaya a la imagen, luego ajuste y umbral.
Un filtro predefinido bajo el método de umbral proporcionará los resultados deseados, destacando las señales más fuertes en rojo. Después de seleccionar el umbral apropiado, presione aplicar. Para analizar el área positiva 6E-10, use la barra de herramientas y haga clic en las pestañas analizar y analizar partículas, asegurándose de que se verifiquen los resultados resumidos.
Copie el resultado del resumen con el área de porcentaje haciendo clic en las pestañas editar y copiar. Luego, pegue el resultado del resumen en el archivo de Excel iniciado previamente con las etiquetas respectivas. Repita el procedimiento para las diferentes regiones del tejido, asegurando que la colocación de cada caja para delinear el ROI sea consistente entre cada imagen.
En esta evaluación representativa, se comparan los métodos de análisis de ROI completo y sub para cuantificar el área positiva 6E-10 en la corteza y los tejidos cerebrales del hipocampo. El análisis completo del ROI implica delinear todo el ROI. Por el contrario, el análisis de sub ROI implica seleccionar una región predefinida dentro del ROI.
El procedimiento escalonado para la cuantificación de área positiva 6E-10 de ROI completo y sub, con rotación de ROI para cuantificación de sub ROI, se muestra aquí. La correlación entre los análisis de ROI completo y sub se demuestra aquí. Se observó una correlación positiva significativa entre el área positiva 6E-10 reportada por los dos lectores que realizaron el análisis sub ROI para la corteza y el hipocampo.
Además, el área positiva promedio por debajo del ROI 6E-10 compartió una correlación positiva fuerte y significativa con el área obtenida utilizando el ROI completo. Para el área media positiva 6E-10 por completo en los análisis de sub ROI, no se observaron diferencias significativas en la corteza y el hipocampo. Se observó una correlación significativa entre el homogeneizado de todo el cerebro y las mediciones solubles de beta amiloide 1-42, por Eliza, y el análisis completo del ROI del estudio La selección del umbral es clave para obtener una cuantificación precisa de los datos.
Se requiere la intervención del usuario para garantizar que las manchas positivas se seleccionen con precisión con el filtro seleccionado. Además de la cuantificación de beta amiloide, este método se puede utilizar para otras inmunomantas fluorescentes. Por ejemplo, Iba-1, de cuantificación de área positiva microglial.
