La estimación del número dopaminérgico de la neurona en el nigra del substantia es una medida dominante del resultado en la investigación de la enfermedad de Parkinson. Este protocolo acorta significativamente la carga de trabajo necesaria para estimar el número de neuronas. Este método proporciona un proceso eficiente y preciso para detectar cambios en el número de neuronas dopaminérgicas y es adecuado para determinar el efecto de las intervenciones sobre la supervivencia celular.
Este método podría adaptarse fácilmente para proporcionar recuentos precisos de neuronas en diferentes regiones del cerebro, manteniendo al mismo tiempo las ventajas de costo y tiempo sobre los métodos estereológicos tradicionales. Para capturar imágenes IHC utilice el software acoplado a un microscopio confocal a un aumento de 10X. Abra el orificio del pasador a 1.5 unidades de área para capturar un plano ancho que totalizará 1.5 micro metros y establezca el enfoque en el lado inyectado del cerebro.
En la pestaña de adquisición, marque la opción de imágenes de escaneo de teselas y establezca las dimensiones en 10 por cuatro. En el panel del modo de adquisición, establezca el zoom en 1.1 para evitar cualquier marca de costura entre las imágenes de escaneo de mosaicos. Establezca el tamaño del fotograma en 1024 por 1024 píxeles y el promedio en dos para garantizar la adquisición de imágenes de alta calidad.
En el panel de canales, establezca la pista uno a Alexa 488 y la pista dos a Alexa 555. Cargue la diapositiva en el escenario y elija una sección con una fuerte tinción de TH. Haga clic en en vivo en el panel de adquisición.
En el panel de canales, establezca la fuerza y la ganancia del láser en niveles que maximicen la señal y limiten el ruido de fondo. Utilice el indicador de rango para asegurarse de que las señales no están sobreexpuestas. Repita esto con varias diapositivas.
En la pestaña adquisición, marque la casilla posiciones. Para comenzar a tomar imágenes, use el ocular y elija la primera sección que muestre una tinción de TH positiva. A continuación, establezca el foco en el punto de interés y mueva el escenario a la línea media de la sección.
Esto guarda la posición en los ejes X, Y y Z y creará una imagen de un escaneo de mosaico que captura toda la sección. Repita esto para todas las demás diapositivas, incluido un sitio sin inyectar. Separe los archivos de imagen utilizando el software adecuado e impórtelos al software de análisis de imágenes automatizado.
Defina una región de interés seleccionando la herramienta de anotación de lápiz para dibujar una anotación alrededor de la sustancia nigra pars compacta. Vaya a la pestaña de análisis y seleccione ajuste en tiempo real en el menú desplegable de análisis. Esto abre una ventana separada en la imagen de la sección que permite la modificación en tiempo real de los parámetros de análisis.
En la sección de ampliación de análisis, seleccione el zoom de imagen adecuado. En la sección de detección celular seleccione el tinte nuclear como el tinte utilizado para la tinción de TH. Ajuste el umbral de contraste nuclear, la intensidad nuclear mínima, la agresividad de segmentación nuclear y los ajustes de tamaño nuclear mientras observa cuidadosamente la ventana de ajuste de tiempo.
Repita este proceso con varias muestras. Una vez que se haya muestreado un número adecuado de imágenes y se haya ajustado el ajuste en tiempo real en consecuencia, guarde la configuración del análisis en el menú desplegable de acciones de configuración. Seleccione todas las imágenes que se analizarán y haga clic en analizar.
Elija la configuración de análisis que se acaba de guardar y en la ventana de la región de análisis marque el cuadro capas de anotación, luego marque la capa uno y haga clic en analizar. Una vez completado, exporte los datos de análisis de resumen para todas las secciones seleccionando la opción exportar datos de análisis de objetos. Este conjunto de datos podría utilizarse para examinar los cambios en el tamaño de la célula en respuesta a una toxina o terapéutica.
Seis semanas después de las inyecciones adeno asociadas del virus o de AAV, la inyección stereotactic del AAV que expresaba el synuclein alfa del mutante A53T en el nigra del substantia en el cerebro de la rata dio lugar a una reducción significativa en la densidad de neuronas dopaminérgicas. El número malo de neuronas positivas del TH por milímetro cuadrado en el nigra del substantia de ratas inyectadas con AAV-A35T fue disminuido perceptiblemente con respecto a el de ratas inyectadas con el vector vacío de AAV. Observaciones similares fueron hechas usando estereología imparcial.
Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que el software es tan útil como está entrenado para ser. Por lo tanto, se debe tener tiempo y cuidado para garantizar que una sola célula se identifique como una sola célula. El software se puede adaptar para medir una intensidad de fluorescencia de otras proteínas de interés como la alfa-sinucleína para determinar si los tratamientos pueden modular los niveles de proteínas.
Esta técnica ha permitido una mayor eficiencia al probar el efecto de múltiples terapias potenciales sobre la densidad de neuronas dopaminérgicas.
