Los productos naturales a menudo se biosintetizan como una clase de compuestos, y no como un solo producto. El filtrado de fragmentación de diagnóstico es un enfoque sencillo para detectar todos los compuestos relacionados estructuralmente dentro de una mezcla compleja. El filtrado de fragmentación de diagnóstico, implementado en el software MZmine, permite al analista explorar conjuntos de datos de espectrometría de masas para nuevos productos naturales que de otro modo se perderían.
Esto incluye nuevos bioproductos, y también nuevas toxinas. El filtrado de fragmentación diagnóstica, aplicado a las clases de toxinas que contaminan los alimentos y el agua, puede informar las evaluaciones de la exposición. Cuando se aplica a extractos microbianos y vegetales, puede resultar en el descubrimiento de nuevos compuestos.
El uso del filtrado de fragmentación de diagnóstico requiere una comprensión de las características clave de espectrometría de masas en tándem que definen una clase química. Esto significa que compuestos estructuralmente similares generarán iones característicos. Mi nombre es Shawn Hoogstra.
Soy técnico de investigación y desarrollador de software en nuestro centro, y voy a demostrar el procedimiento. Para preparar una muestra para el análisis de microcistina, inocular 30 mililitros de medio de crecimiento de cianobacterias estériles a aproximadamente cinco veces-10 a la quinta célula por mililitro, en condiciones asépticas, en frascos Erlenmeyer de 250 mililitros, monitoreando la densidad celular con un hemocitometro. Después de 26 días de cultivo fotoautotrófico, iluminado con luz fluorescente blanca fría utilizando un régimen de 12 horas de luz oscura a 27 grados Centígrados, con remolino una vez al día, utilice papeles de filtro de microfibra de vidrio GF/C de 47 mililitros de diámetro para separar las células del medio de cultivo por filtración al vacío.
Añadir tres mililitros de 80%metanol a las células cosechadas en tubos de ensayo de 14 mililitros, y vórtice y posteriormente sonicar cada tubo durante 30 segundos. Después de la sonicación, lise las muestras con tres ciclos consecutivos de una hora, menos 20 grados-Celsius y descongelación de temperatura ambiente de 15 minutos, y filtre cada extracto de célula de cianobacteria resultante a través de filtros individuales de jeringa de politetrafluoroetileno de 0,22 micrómetros. Usando una corriente suave de gas nitrógeno, seque los extractos con un evaporador a 30 grados Celsius, y almacene los extractos secos a menos 20 grados Celsius.
Para el análisis de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida, reconstituya el residuo seco que se analizará con 500 microlitros de 90% metanol y vórtice las muestras durante 30 segundos. Transfiera a un vial de cromatografía líquida de alta presión ámbar. A continuación, analice el extracto de cianobacterias utilizando un método de adquisición dependiente de datos en un espectrómetro de masas de alta resolución de acuerdo con los protocolos estándar.
La mayoría de las microcistinas contienen un residuo ATA que produce dos iones de producto de diagnóstico en espectrometría de masas en tándem, M a Z 135.0803 y 163.1114. Para la preparación de conjuntos de datos de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida no dirigida, abra MZmine 2 y seleccione Importación de datos sin procesar"en El menú desplegable Métodos de datos sin procesar". A continuación, seleccione los archivos de datos del análisis de microcistina y seleccione el filtro de selección de picos para aplicar un algoritmo de centroide proporcionado por el proveedor.
Para el filtrado de fragmentación de diagnóstico, o DFF, de los archivos de adquisición dependientes de datos importados, utilice el cursor para resaltar los archivos de datos y abra el menú desplegable Visualización"para seleccionar la opción DFF. En el cuadro de diálogo DFF que aparece, introduzca el intervalo de tiempos y minutos de retención cuando la clase de analitos objetivo elurácea y para encontrar el rango de relación masa-carga de la clase de analitos objetivo, incluida la posibilidad de múltiples compuestos cargados cuando corresponda. Introduzca la precisión de masa de espectrometría de masas en tándem alcanzable del instrumento de espectrometría de masas e introduzca los iones de producto específicos de la clase de la relación masa-carga.
Introduzca las pérdidas neutrales específicas de la clase y defina la intensidad mínima para los iones de productos de diagnóstico y/o las pérdidas neutrales que se considerarán como un porcentaje del pico base de los espectros de espectrometría de espectrometría de masas en tándem. A continuación, seleccione una ruta de acceso y un nombre de archivo para generar los resultados y haga clic en Aceptar"para iniciar el DFF. Una gráfica DFF aparecerá una vez completada correctamente la configuración.
El analista debe interpretar espectros de masa en tándem de compuestos conocidos dentro de una clase compuesta para identificar los iones de producto y/o pérdidas neutrales que son diagnósticos para toda la clase de compuestos. Esta gráfica DFF se generó tras el análisis de M.aeruginosa CPCC 300. El eje X representa esta relación masa-carga de los iones precursores que satisfacían los criterios de DFF definidos, mientras que el eje Y muestra la relación masa-carga de todos los iones de producto dentro de los espectrometrías de espectrometría de masas en tándem de microcistinas.
Para este análisis, los criterios para la detección de microcistina incluyeron iones precursores dentro de la relación masa-carga de 400 a 1.200, y tiempos de retención entre dos y seis minutos. Lo más importante es que estos espectros de espectrometría de masas en tándem contenían ambas relaciones masa-carga por encima del umbral de intensidad pico de base definido del 15%. De los 4, 116 espectros de espectrometría de masas en tándem adquiridos durante el análisis, 26 cumplieron con los criterios DFF y se detectaron en el extracto de M.aeruginosa CPCC 300.
Las principales microcistinas detectadas podrían asignarse con confianza como microcistina leucina arginina y ácido aspartato desmetado microcistina leucina arginina. A medida que se descubren nuevos compuestos utilizando filtrado de fragmentación diagnóstica, los organismos pueden ser cultivados a gran escala para el aislamiento y caracterización de los compuestos por RMN. Cuando se aplica a las microcistinas, el filtrado de fragmentación de diagnóstico nos permite determinar si los métodos tradicionales de cribado dirigidos detectan las principales toxinas presentes en una muestra.
