Este protocolo detalla el desarrollo de poblaciones robustas de TILLING con alta frecuencia de mutación por ems mutagénesis en cultivos de grano pequeño. Las poblaciones de TILLING se pueden utilizar para la genómica funcional, así como para el descubrimiento de genes del espacio genético hacia adelante en cultivos de granos pequeños. Las poblaciones DE TILLING desarrolladas con esta técnica tienen altas frecuencias de mutación, y este protocolo se puede aplicar a cualquier genotipo.
La detección de mutaciones basada en el ensayo Cel-1 se puede llevar a cabo utilizando equipos básicos de laboratorio. El paso más importante es determinar la concentración óptima de EMS. Por lo tanto, una curva de dosificación EMS debe hacerse específicamente para la población individual.
Para empezar, remoja 100 semillas con el genotipo de interés en cada uno de los seis matraces de vidrio de 250 mililitros, que contienen 50 mililitros de agua destilada. Agitar a 100 RPM durante ocho horas a temperatura ambiente para la imbibición. A continuación, en una campana de humo, preparar 50 mililitros de soluciones EMS de cinco concentraciones diferentes mediante la mezcla de líquido EMS y agua destilada.
Después de la inbibición, decantar el agua de cinco matraces. Añadir 50 mililitros de solución EMS en cada uno de los cinco matraces que contienen semillas impregnadas. Agitar los matraces durante 16 horas a 75 RPM y temperatura ambiente.
Ahora, decantar la solución emS en una botella de desecho vacía y verter las semillas tratadas en la tela de queso colocadas en una botella de desecho vacía para recogerlas por separado para cada tratamiento. Use agua extra para ayudar a verter las semillas. Además, rocíe varios mililitros de solución inactivadora de EMS en la pared de los matraces contaminados.
Y sumerja las puntas de pipeta usadas en la solución durante 24 horas. Inactivar la solución EMS utilizada mediante la adición de un volumen de solución de inactivación de EMS para tratar durante 24 horas. Con una corbata de torsión, sostenga las semillas tratadas con EMS dentro de la tela de queso y lave con agua corriente del grifo durante dos horas.
Después del lavado, trasplantar cada semilla individualmente en entrenadores de raíces que contengan tierra para macetas. Cultivar plantas a 20 a 25 grados centígrados durante un período de luz de 16 horas. Después de 15 días de trasplante, revise las plantas y cuente el número de semillas que no germinaron.
Registrar datos de supervivencia vegetal. Si la tasa de supervivencia no está dentro de 40 a 60%realizar una segunda ronda de optimización de dosificación con una concentración modificada hasta lograr la tasa de letalidad deseada de 40 Para 60%Después del experimento de mutagénesis, recoger el tejido de la hoja de las plantas M2 en una caja de recolección de tejido de 96 pozos. El tejido se recoge de plantas M2 que fueron cultivadas a partir de plantas de M1 autoatadas.
Se muestra una planta M2 de cada planta M1. Extraiga ADN utilizando un kit de extracción de ADN vegetal con un sistema de purificación de ADN siguiendo las recomendaciones del fabricante. A continuación, cargue dos microlitros del extracto de ADN en placas LV con 16 ranuras.
Cuantifique el ADN utilizando un espectrofotómetro a longitudes de onda de 260 y 280 nanómetros. Diluir la concentración de ADN a 25 nanogramos por microlitro con agua libre de nucleasas. Cree cuatro acumulaciones de ADN de 200 microlitros combinando el ADN de cada pozo en los cuatro bloques de pozos 96 en una placa de piscina mientras mantiene la identidad de fila y columna de cada muestra.
A continuación, prepare un tubo de mezcla maestro de PCR para imprimaciones específicas genéticas añadiendo en cada tampón de PCR de tubo, imprimaciones hacia adelante y hacia atrás, y ADN polimerasa según el manuscrito. Aliquot la mezcla maestra en los pozos de una placa PCR de 96 pozos. A continuación, agregue la plantilla de ADN agrupada.
Cargue los tubos PCR en un ciclor térmico y utilice un perfil de touchdown para ejecutar la reacción PCR en el ciclor térmico. Para generar heteroduplexes entre DNAs no coincidentes, incubar productos de PCR en el ciclo térmico en un programa diferente. A continuación, agregue 2,5 microlitros de endonucleasa Cel-1 casera a cada uno de los productos de PCR heteroduplexed.
Incubar durante 45 minutos a 45 grados centígrados. Después de eso, terminar la reacción Cel-1 mediante la adición de 2,5 microlitros de 0,5 molar EDTA a pH ocho. Cargue 30,5 microlitros de cada producto tratado Con Cel-1 mezclado con cinco microlitros de tinte en un gel de 3% agarosa y corra a 100 voltios durante dos horas y media.
Para desconvoluntar piscinas mutantes, determinar la cigosidad de los mutantes mediante la ejecución de dos reacciones PCR para el ADN M2 individual en el que la primera reacción contiene 2,5 microlitros de ADN M2 y 2,5 microlitros de ADN de tipo salvaje y la segunda reacción contiene sólo cinco microlitros de ADN M2. Este protocolo muestra la mutagenización del SME de los cultivos de granos pequeños y la caracterización de mutantes. La curva de dosificación indica dosis óptimas de EMS para las tasas de supervivencia deseadas del 50% para tres especies diferentes de trigo.
La presencia de fenotipos fácilmente identificables en la población M2 confirma la eficacia de la mutagénesis en poblaciones de granos pequeños. Aquí hay cuatro ejemplos de los fenotipos mutantes en las poblaciones M2 TILLING, un mutante albino en una población de cebada M2, un mutante de cloro en una población de cebada M2, un mutante variado con decoloración rosa en una población de Aegilops tauschii M2, y un mutante de baja labranza en una población de Triticum monococcum M2. Una identificación mutante usando Cel-1 en plataformas de gel de agarosa muestra una posible piscina mutante identificada de 12 piscinas mutantes por bandas únicas.
La desconvolución de las piscinas mutantes determinó la cigosidad de la mutación y ayudó a rastrear la mutación hasta muestras individuales. La piscina A4 tenía mutaciones heterocigotas, indicadas por bandas cortadas en muestras de ADN de tipo salvaje de la caja 4 y de la caja 4. La piscina H5 contenía mutaciones homocigotas, ya que las bandas únicas de corte sólo estaban presentes en la muestra de ADN de tipo salvaje de la caja 5 H5.
El paso más importante es determinar la concentración óptima de EMS para lograr una tasa de letalidad de 40 a 60%. Una vez que se ha desarrollado una población TILLING con una alta frecuencia de mutación, se puede utilizar para la caracterización funcional de cualquier gen de interés. Además, la población puede ser una fuente de variación genética útil para la mejora de los cultivos.
TILLING se ha utilizado ampliamente para estudios genómicos funcionales en plantas modelo y de cultivo. La gama de mutaciones obtenidas puede ser missents, knockouts, silent, o incluso misspliced forms. El SME es un mutágeno.
Por lo tanto, utilice el equipo de protección personal adecuado mientras manipula el EMS. Descontamine las soluciones sobrantes y las puntas de pipeta usadas.
