פרוטוקול זה מפרט את הפיתוח של אוכלוסיות TILLING חזקות עם תדירות מוטציה גבוהה על ידי MUTAGENESIS EMS בגידולי תבואה קטנים. אוכלוסיות TILLING יכולות לשמש לגנומיקה תפקודית, כמו גם לגילוי גנים של חלל גנטי קדימה בגידולי תבואה קטנים. לאוכלוסיות TILLING שפותחו באמצעות טכניקה זו יש תדרי מוטציה גבוהים, ופרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל גנוטיפ.
זיהוי מוטציה מבוססת בדיקה Cel-1 יכול להתבצע באמצעות ציוד מעבדה בסיסי. הצעד החשוב ביותר הוא לקבוע את הריכוז ה-EMS האופטימלי. לכן, עקומת מינון EMS צריך להתבצע במיוחד עבור האוכלוסייה הבודדת.
כדי להתחיל, להשרות 100 זרעים עם גנוטיפ של עניין בכל אחד שישה 250 בקבוקי זכוכית מיליליטר, המכיל 50 מיליליטר של מים מזוקקים. יש לנער ב-100 סל"ד במשך שמונה שעות בטמפרטורת החדר לצורך אימביציה. לאחר מכן, במכסה המנוע אדים, להכין 50 מיליליטר של פתרונות EMS של חמישה ריכוזים שונים על ידי ערבוב נוזל EMS ומים מזוקקים.
לאחר ההתגלות, מפענחים את המים מתוך חמישה בקבוקונים. הוסף 50 מיליליטר של פתרון EMS בכל אחד מחמשת הבקבוקים המכילים זרעים בלתי מומרים. לנער את flasks במשך 16 שעות ב 75 סל"ד וטמפרטורת החדר.
עכשיו, decant פתרון EMS לתוך בקבוק פסולת ריקה ויוצקים את הזרעים המטופלים על cheesecloth להציב על בקבוק פסולת ריק לאסוף בנפרד עבור כל טיפול. השתמש במים נוספים כדי לעזור לשפוך את הזרעים. כמו כן, לרסס כמה מיליליטר של EMS השבתת פתרון על הקיר של בקבוקונים מזוהמים.
ולטבול טיפים פיפטה משומשים בתסרון במשך 24 שעות. לא פעיל פתרון EMS בשימוש על ידי הוספת אמצעי אחסון אחד של EMS השבתת פתרון לטיפול במשך 24 שעות. באמצעות עניבת טוויסט, להחזיק את הזרעים שטופלו EMS בתוך מטלית הגבינה ולשטוף תחת מי ברז זורמים במשך שעתיים.
לאחר הכביסה, להשתיל כל זרע בנפרד לתוך מאמני שורש המכיל אדמה השתילה. לגדל צמחים ב 20 עד 25 מעלות צלזיוס לתקופת אור של 16 שעות. לאחר 15 ימים של השתלה, לבדוק את הצמחים ולספר את מספר הזרעים שלא הצליח לנבוט.
נתוני שיא של הישרדות צמחים. אם שיעור ההישרדות הוא לא בתוך 40 כדי 60%לנהל סיבוב שני של אופטימיזציה המינון עם ריכוז שונה עד להשגת שיעור הקטלניות הרצוי של 40 עד 60% לאחר הניסוי mutagenesis, לאסוף את רקמת העלה של צמחים M2 בתיבה 96 גם איסוף רקמות. רקמה נאספת מצמחי M2 אשר גדלו מצמחים M1 עצמית.
צמח M2 אחד מוצג מכל צמח M1. לחלץ DNA באמצעות ערכת מיצוי DNA צמח עם מערכת טיהור DNA בעקבות המלצות היצרן. לאחר מכן, לטעון שני microliters של תמצית ה-DNA לתוך לוחות LV עם 16 חריצים.
לכמת דנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר באורכי גל של 260 ו-280 ננומטר. מדללים את ריכוז הדנ"א ל-25 ננוגרם למיקרוליטר עם מים נטולי גרעין. צור ארבע פעמים מאגרי DNA של 200 microliters על ידי שילוב ה-DNA מכל באר בארבעה 96 בלוקים היטב לתוך צלחת הבריכה תוך שמירה על זהות השורה והעמודה של כל מדגם.
לאחר מכן, הכינו צינור ערבוב ראשי של PCR עבור פריימרים ספציפיים לגנים על ידי הוספה לכל מאגר PCR צינור, פריימרים קדימה ואחוריים, ופולימראז DNA על פי כתב היד. Aliquot את התערובת הראשית לתוך בארות של צלחת PCR 96 היטב. לאחר מכן, הוסף את תבנית הדנ"א המפולגת.
טען את צינורות PCR לתוך מחזור תרמי, ולהשתמש בפרופיל טאצ'דאון כדי להפעיל את תגובת PCR על האופניים התרמיים. כדי ליצור הטרודופלקסים בין DNAs לא תואמים, דגירה מוצרי PCR במחזור התרמי בתוכנית אחרת. לאחר מכן, להוסיף 2.5 microliters של אנדונוקלאז Cel-1 תוצרת בית לכל אחד מוצרי PCR heteroduplexed.
דגירה במשך 45 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לסיים את תגובת Cel-1 על ידי הוספת 2.5 microliters של 0.5 EDTA טוחן ב pH שמונה. טוענים 30.5 מיקרוליטרים של כל מוצר שטופל ב-Cel-1 מעורבב עם חמישה מיקרוליטרים של צבע על ג'ל 3%agarose ורץ ב-100 וולט למשך שעתיים וחצי.
כדי deconvolute בריכות מוטנטים, לקבוע את הזיגוסיטיות של מוטנטים על ידי הפעלת שתי תגובות PCR עבור DNA M2 בודדים שבו התגובה הראשונה מכילה 2.5 microliters של M2 DNA ו 2.5 microliters של סוג הבר DNA ואת התגובה השנייה מכילה רק חמישה microliters של M2 DNA. פרוטוקול זה מראה מוטציה EMS של גידולי תבואה קטנים ואת האפיון של מוטציה. עקומת המינון מצביעה על מינוני EMS אופטימליים עבור שיעורי ההישרדות הרצויים של 50% עבור שלושה מינים שונים של חיטה.
נוכחותם של פנוטיפים הניתנים לזיהוי בקלות באוכלוסיית M2 מאשרת את האפקטיביות של mutagenesis באוכלוסיות תבואה קטנות. להלן ארבע דוגמאות של פנוטיפים מוטנטים באוכלוסיות M2 TILLING, מוטנט לבקן באוכלוסיית שעורה M2, מוטציית כלורינה באוכלוסיית שעורה M2, מוטציה מגוונת עם שינוי צבע ורוד באוכלוסיית Aegilops tauschii M2, ומוטנט נמוך ב- Triticum monococcum M2 אוכלוסייה. זיהוי מוטנטים באמצעות Cel-1 על פלטפורמות ג'ל אגרוז מראה בריכת מוטנטים פוטנציאלית שזוהתה מתוך 12 בריכות מוטנטים על ידי להקות מחשוף ייחודיות.
פירוק בריכות המוטנטים קבע את הזיגוסיטיות של המוטציה ועזר לאתר את המוטציה לדגימות בודדות. בבריכת A4 היו מוטציות הטרוזיגיות, שצוינו על ידי להקות מחשוף הן בתיבה 4 והן בתיבה 4 דגימות DNA מסוג פראי. בריכת H5 הכילה מוטציות הומוזיגניות כמו להקות מחשוף ייחודיות היו נוכחים רק בתיבה 5 H5 סוג הבר דגימת DNA.
הצעד החשוב ביותר הוא לקבוע את הריכוז האופטימלי של EMS כדי להשיג 40 עד 60% קטלניות שיעור. לאחר שאוכלוסיית TILLING עם תדר מוטציה גבוה פותחה ניתן להשתמש בה לאפיון תפקודי של כל גן מעניין. בנוסף, האוכלוסייה יכולה להיות מקור של וריאציה גנטית שימושית לשיפור היבול.
TILLING שימש בהרחבה למחקרים גנומיים פונקציונליים בצמחי מודל ויבול. מגוון המוטציות המתקבלות יכול להיות מיסנטים, נוקאאוטים, צורות שקטות או אפילו מוטעות. EMS הוא מוטגאן.
לכן, השתמש בציוד מגן אישי מתאים בעת הטיפול ב- EMS. לטהר שאריות פתרונות והשתמש טיפים פיפטה.
