Questo protocollo descrive in dettaglio lo sviluppo di robuste popolazioni TILLING ad alta frequenza di mutazione da parte della mutagenesi EMS nelle piccole colture di cereali. Le popolazioni TILLING possono essere utilizzate per la genomica funzionale, così come per la scoperta avanzata di geni genetici spaziali in piccole colture di cereali. Le popolazioni TILLING sviluppate utilizzando questa tecnica hanno alte frequenze di mutazione, e questo protocollo può essere applicato a qualsiasi genotipo.
Il rilevamento delle mutazioni basato sul test Cel-1 può essere condotto utilizzando apparecchiature di laboratorio di base. Il passo più importante è determinare la concentrazione ottimale dello SME. Pertanto, una curva di dosaggio dello SME dovrebbe essere fatta specificamente per la singola popolazione.
Per iniziare, immergere 100 semi con il genotipo di interesse in ciascuno dei sei contenitori di vetro da 250 millilitri, contenenti 50 millilitri di acqua distillata. Agitare a 100 giri/min per otto ore a temperatura ambiente per l'imbibizione. Quindi, in una cappa aspirante, preparare 50 millilitri di soluzioni EMS di cinque diverse concentrazioni mescolando liquido EMS e acqua distillata.
Dopo l'imbibizione, decantare l'acqua da cinque fiasche. Aggiungere 50 millilitri di soluzione EMS in ciascuno dei cinque contenitori contenenti semi imbibati. Agitare i contenitori per 16 ore a 75 giri/min e a temperatura ambiente.
Ora, decantare la soluzione EMS in una bottiglia di scarto vuota e versare i semi trattati su una tela di formaggio posta su una bottiglia di rifiuti vuota da raccogliere separatamente per ogni trattamento. Utilizzare acqua extra per aiutare a versare i semi. Inoltre, spruzzare diversi millilitri di soluzione inattivante EMS sulla parete dei contenitori contaminati.
E immergere le punte delle pipette usate nella soluzione per 24 ore. Inattiva la soluzione EMS utilizzata aggiungendo un volume di soluzione inattivante EMS da trattare per 24 ore. Utilizzando una cravatta a torsione, tenere i semi trattati con EMS all'interno della tela da formaggio e lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per due ore.
Dopo il lavaggio, trapiantare ogni seme singolarmente in addestratori di radici contenenti terreno invaso. Coltiva piante da 20 a 25 gradi Celsius per un periodo di luce di 16 ore. Dopo 15 giorni di trapianto, controlla le piante e conta il numero di semi che non sono riusciti a germinare.
Registrare i dati sulla sopravvivenza delle piante. Se il tasso di sopravvivenza non è entro il 40-60% condurre un secondo ciclo di ottimizzazione del dosaggio con una concentrazione modificata fino a raggiungere il tasso di letalità desiderato dal 40 al 60%Dopo l'esperimento di mutagenesi, raccogliere il tessuto fogliare delle piante M2 in una scatola di raccolta dei tessuti di 96 pozzi. Il tessuto viene raccolto da piante M2 che sono state coltivate da piante M1 auto-etere.
Un impianto M2 viene mostrato da ogni impianto M1. Estrarre il DNA utilizzando un kit di estrazione del DNA vegetale con un sistema di purificazione del DNA seguendo le raccomandazioni del produttore. Quindi, caricare due microlitri dell'estratto di DNA in piastre LV con 16 fessure.
Quantificare il DNA usando uno spettrofotometro a lunghezze d'onda di 260 e 280 nanometri. Diluire la concentrazione di DNA a 25 nanogrammi per microlitro con acqua priva di nucleasi. Creare quattro volte i pool di DNA di 200 microlitri combinando il DNA di ogni pozzo nei quattro blocchi di pozzo 96 in una piastra da biliardo mantenendo l'identità di fila e colonna di ogni campione.
Successivamente, preparare un tubo di mix master PCR per primer specifici del gene aggiungendo in ogni tubo tampone PCR, primer avanti e indietro e DNA polimerasi secondo il manoscritto. Aliquotare il master mescolare nei pozzali di una piastra PCR da 96 po' di pozzo. Quindi, aggiungi il modello di DNA in pool.
Caricare i tubi PCR in un ciclore termico e utilizzare un profilo di touchdown per eseguire la reazione PCR sul ciclore termico. Per generare eteroduplex tra DNA non corrispondenti, incubare i prodotti PCR nel ciclore termico in un programma diverso. Quindi, aggiungere 2,5 microlitri di endonucleasi Cel-1 fatta in casa a ciascuno dei prodotti PCR eteroduplex.
Incubare per 45 minuti a 45 gradi Celsius. Successivamente, terminare la reazione Cel-1 aggiungendo 2,5 microlitri di EDTA molare 0,5 a pH otto. Caricare 30,5 microlitri di ogni prodotto trattato con Cel-1 miscelato con cinque microlitri di colorante su un gel di agarosio al 3% e correre a 100 volt per due ore e mezza.
Per deconvolutare le piscine mutanti, determinare la zigomità dei mutanti eseguendo due reazioni PCR per il singolo DNA M2 in cui la prima reazione contiene 2,5 microlitri di DNA M2 e 2,5 microlitri di DNA di tipo selvatico e la seconda reazione contiene solo cinque microlitri di DNA M2. Questo protocollo mostra la mutagenizzazione dello SME delle colture di piccoli cereali e la caratterizzazione dei mutanti. La curva di dosaggio indica dosi ottimali di SME per i tassi di sopravvivenza desiderati del 50% per tre diverse specie di grano.
La presenza di fenotipi facilmente identificabili nella popolazione M2 conferma l'efficacia della mutagenesi nelle piccole popolazioni di cereali. Ecco quattro esempi dei fenotipi mutanti nelle popolazioni M2 TILLING, un mutante albino in una popolazione di orzo M2, un mutante clorina in una popolazione di orzo M2, un mutante variegato con scolorimento rosa in una popolazione di Aegilops tauschii M2 e un mutante a bassa lavorazione in una popolazione di Triticum monococcum M2. Un'identificazione mutante usando Cel-1 su piattaforme di gel di agarosio mostra un potenziale pool mutante identificato su 12 piscine mutanti da bande di fenoiatura uniche.
La deconvoluzione delle piscine mutanti determinò la zigomità della mutazione e aiutò a rintracciare la mutazione fino a singoli campioni. Il pool A4 aveva mutazioni eterozigoti, indicate da bande sciccate sia nei campioni di DNA selvatico Box 4 che Box 4. Il pool H5 conteneva mutazioni omozigoti in quanto bande di cleaved uniche erano presenti solo nel campione di DNA di tipo selvatico Box 5 H5.
Il passo più importante è determinare la concentrazione ottimale dello SME per raggiungere il tasso di letalità dal 40 al 60%. Una volta sviluppata una popolazione TILLING con un'alta frequenza di mutazione può essere utilizzata per la caratterizzazione funzionale di qualsiasi gene di interesse. Inoltre, la popolazione può essere una fonte di utili variazioni genetiche per il miglioramento delle colture.
TILLING è stato ampiamente utilizzato per studi genomici funzionali in modelli e piante coltivate. La gamma di mutazioni ottenute può essere missents, knockout, forme silenziose o addirittura misspliced. Lo SME è un mutageno.
Pertanto, utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione dello SME. Soluzioni di avanzi decontaminati e punte di pipetta usate.
