Nuestro protocolo permite la creación de enzimas de restricción con especificidades de secuencia alteradas y más estrictas utilizando la compartimentación in vitro y una estrategia de selección única en la evolución dirigida. Potencialmente es bastante universal, ya que debería ser aplicable a cualquier restricción endonucleasa y la selección se puede dirigir hacia cualquier versión más estricta de una secuencia de cognilla original. Si las variantes recién creadas se expresan mediante la transcripción-traducción in vitro, el protocolo es adecuado no sólo para reducir la especificidad, sino también para alterar la especificidad.
Para decidir los sitios de mutagénesis de subsaturación, elija las frecuencias de mutagénesis de acuerdo con la importancia hipotética de los sitios, teniendo en cuenta los límites de la complejidad general de la biblioteca. Para comenzar la síntesis, inserte columnas que hayan sido embaladas con nueva resina en el sintetizador. Sintetizar oligonucleótidos en todas las columnas hasta el triplete, inmediatamente antes de la segunda subsaturación del sitio de mutagenesis contando desde el extremo de tres primos.
Sintetizar, dejando un grupo de trityl de cinco primos al final. El grupo protector se eliminará al comienzo del siguiente ciclo de síntesis. Abra las columnas de síntesis y centrifugar brevemente en tubos secos de 1,5 mililitros para recoger la resina.
Tire del soporte de síntesis de CPG y mezcle por vórtice. Vuelva a particionar la resina CPG mixta en nuevas columnas de síntesis. Evite introducir humedad porque disminuirá el rendimiento general.
Continuar la síntesis, a partir del triplete del sitio de mutagénesis de la subsaturación. Asigne columnas a trillizos NNS aleatorios o trillizos de tipo salvaje de acuerdo con la frecuencia de mutagénesis deseada. Si hay sitios de subsaturación adicionales, diríjase únicamente al triplete anterior al siguiente sitio de mutagénesis de subsaturación.
Si no hay más sitios de subsaturación en el nivel inferior, complete la síntesis, dejando un grupo de trityl de cinco primos al final. Utilice puntas de pipeta de diámetro ancho para preparar una mezcla de tensioactivo de aceite añadiendo 225 microlitros de Span 80 y 25 microlitros de Tween 80 a cinco mililitros de aceite mineral en un tubo cónico de 15 mililitros. Mezclar bien por inversión suave 15 veces.
La mezcla en este paso debe ser translúcida. Para cada biblioteca, transfiera 950 microlitros de la mezcla de tensioactivos de aceite a un vial criogénico de fondo redondo de dos mililitros. Etiqueta con un nombre de biblioteca y transfiérala al hielo.
Coloque una pequeña barra de agitación cilíndrica en cada vial. Preparar una mezcla de reacción de transcripción-traducción in vitro de acuerdo con las sugerencias del fabricante. Complementar la mezcla con cloruro de magnesio a una concentración final de 1,5 milimolares.
Dispensar 50 microlitros alícuotas de la mezcla de reacción en tubos de 1,5 mililitros sobre hielo. Añadir 1.7 femtomoles de la biblioteca a la mezcla de reacción sobre hielo. Prepare la emulsión de agua en aceite consecutivamente para cada biblioteca colocando primero un vaso pequeño lleno de hielo en un agitador magnético con la velocidad de agitación establecida en 1150 RPM.
A continuación, transfiera un vial criogénico con 950 microlitros de mezcla de tensioactivos de aceite y una pequeña barra de agitación a un vaso de precipitados helado en el agitador magnético. Compruebe que la barra de agitación esté girando. Agregue cinco alícuotas de 10 microlitros de la mezcla de transcripción-traducción de la biblioteca in vitro durante un período de dos minutos en intervalos de 30 segundos y continúe agitando durante un minuto adicional.
Transfiera el vial con la emulsión a un recipiente de hielo. En este punto, el líquido debe ser opaco, no translúcido. A continuación, continúe con la siguiente biblioteca.
Después de que se procesen todas las bibliotecas, inicie la incubación de todas las bibliotecas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante del kit. Transfiera los viales a la temperatura óptima para la endonucleasa de ingeniería durante dos horas adicionales antes de colocarlos sobre hielo durante al menos 10 minutos. Transfiera las emulsiones de los viales criogénicos a tubos de 1,5 mililitros.
Añadir un microlitro de 5 molares EDTA. Y centrifugarlos a 13.000 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Si después de la centrifugación no puede ver claramente la interfaz agua-aceite, congele la mezcla antes de la aspiración de la fase superior del aceite.
Mueva la fase superior del aceite con una pipeta y deseche. Realice inmediatamente la extracción añadiendo 150 microlitros de cloroformo de fenol y 100 microlitros de tris-HCl mililar a la fase acuosa. Vórtice y luego realizar la separación de fase por centrifugación de 30 segundos a 13.000 veces g.
Recoger la fase acuosa superior. Precipite el ADN añadiendo 15 microlitros de acetato de sodio de tres molares, 2,5 a cinco microgramos de glucógeno y 375 microlitros de etanol. Después de incubar las muestras a menos-20 grados Celsius durante una hora, centrifugar durante 15 minutos a 13.000 veces g, cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante y lave brevemente el pellet con un mililitro de etanol frío al 70%. Seque el pellet de glucógeno de ADN en una aspiradora de velocidad o secador de aire durante más de cinco minutos. Luego disuelve el pellet en 50 microlitros de 10 tris-HCl mililolares.
A continuación, añada cinco microlitros de perlas magnéticas de estreptavidina, preparadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar durante una hora a temperatura ambiente, preferiblemente en un mezclador de carrusel o por vórtices suaves. Transfiera los tubos a un soporte magnético para separar las perlas.
A continuación, recoger el líquido enriquecido en ADN sin biotina. Este protocolo es una herramienta para aumentar la frecuencia de las variantes deseadas de endonucleasas de restricción diseñadas agotando enzimas inactivas y endonucleasas con especificidad de secuencia de tipo salvaje sin cambios. El cribado exitoso puede identificar hasta un 20% de variantes prometedoras.
Las variantes se etiquetan como variantes prometedoras si producen un patrón de escote distinto de la enzima de tipo salvaje. Las variantes que podrían haber alterado la preferencia de secuencia también se etiquetan. Aquí se muestra un cribado fallido con la mayoría de la varianza inactiva y una variante con patrón de escote aparentemente inalterado.
En este caso, las bibliotecas probablemente están dominadas por variantes inactivas que escaparon del paso de selección de captura de streptavidin. Es fundamental diseñar cuidadosamente las secuencias seleccionadas y contraseleccionados y limitar la diversidad de bibliotecas mediante una estrategia de mutagénesis que genere sustituciones en solo unas pocas posiciones seleccionadas. Las mejores variantes seleccionadas deben caracterizarse a fondo para la cinética de unión y escote en secuencias preferidas y no cortadas en función de los resultados del cribado inicial.
En nuestro caso de prueba, los sitios de mutagénesis fueron seleccionados en base a un modelo de homología. Sorprendentemente, una estructura cristalina más tarde mostró que algunos residuos alterados probablemente no están en contacto directo con el ADN.
