Nuestro protocolo es significativo porque proporciona el primer método cuantitativo ex vivo para evaluar la motilidad espontánea de un útero intacto. Este enfoque novedoso proporciona una alternativa fácil y menos costosa para probar el potencial relajante de remedios naturales en compuestos sintéticos. Una de las principales ventajas de esta técnica es que todas las interacciones celulares intrauterinas permanecen intactas durante todo el experimento.
La contrailidad excesiva del útero se asocia con la dismenorrea, para la cual los relajantes uterinos pueden ser útiles para el tratamiento. Este método proporciona una manera fácil de probar nuevos relajantes. Después de confirmar la etapa del ciclo estroso, coloque el ratón en la posición supina y extienda las extremidades para exponer la región pélvica abdominal.
Humedezca el abdomen con 70%etanol y use fórceps para levantar cuidadosamente la piel superior al clítoris. Hacer pequeñas incisiones transversales en los aspectos laterales de la zona abdominal inferior hasta las extremidades superiores para exponer el peritoneo. Corte cuidadosamente a través del peritoneo para exponer el tracto gastrointestinal sin dañar los cuernos uterinos, y utilizar fórceps para eliminar la fascia y el tejido adiposo que cubre el tracto gastrointestinal.
Retire el duodeno, el yeyuno, el íleon, el cecum y el colon ascendente y transversal. Localice la vejiga urinaria para localizar la vagina que se encuentra directamente debajo de la vejiga urinaria. Localice la sínfisis púbica en la confluencia de los huesos púbicos, caudal a la vejiga, y use tijeras para hacer cuidadosamente una incisión en los lados laterales de la sínfisis púbica a través del tejido fibrocartilaginoso interpúbico para acceder y proporcionar una ruta para la extracción vaginal.
Cortar a través del perineo situado entre el ano y la parte inferior de la vulva, y utilizar fórceps para levantar la vagina para permitir una escisión lenta del recto. Identifique los dos cuernos uterinos que se bifurcan en un tenedor rostralmente a la vagina y localice un oviducto y un ovario enrevesados al final de cada cuerno. Identificar correctamente los cuernos uterinos es fundamental para el procedimiento para asegurar que los tejidos no estén dañados.
Usa pequeñas tijeras diseccionantes para quitar los ligamentos que se conectan y sostienen los cuernos, los oviductos y los ovarios dentro de la cavidad abdominal, y extirpar la vagina, el útero, los oviductos y los ovarios. Transfiera todo el tracto reproductivo aislado en un plato petri de 100 milímetros que contenga 10 mililitros de PBS de Dulbecco. Utilice fórceps y tijeras quirúrgicas para eliminar cualquier tejido conectivo y adiposo que rodea los cuernos uterinos y la vagina, así como cualquier pelaje en la región púbica que pueda obstaculizar la calidad de la imagen.
Retire el ligamento ancho para permitir la motilidad de los cuernos uterinos y lave el tejido dos veces con PBS fresco de Dulbecco por lavado antes de transferir el tracto reproductivo aislado a un plato Petri de 35 milímetros que contenga tres mililitros de solución de Krebs oxigenado. Para la motilidad espontánea, coloque el plato Petri sobre una superficie negra a temperatura ambiente y espere de 15 a 30 minutos para que comiencen las contracciones espontáneas. Cuando se pueda observar movimiento, registre la motilidad uterina espontánea durante 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de video digital.
A continuación, transfiera la preparación a un plato de Petri que contenga un tampón Krebs oxigenado complementado con el compuesto de prueba y registre la motilidad uterina espontánea durante 10 minutos adicionales de la misma manera. Al final del período de grabación, lave todo el tracto reproductivo en 10 mililitros de PBS de Dulbecco en una placa Petri de 100 milímetros, y transfiera la muestra a un nuevo plato Petri de tampón Krebs recién oxigenado para evaluar la reversibilidad del tratamiento. Registre la motilidad uterina espontánea durante unos 10 minutos de la misma manera, como en las dos últimas grabaciones.
Luego transfiera la preparación a otro plato Petri de 35 milímetros lleno de tampón Krebs oxigenado complementado con el vehículo para el compuesto de prueba para asegurarse de que no hay cambios inducidos mecánicamente en la motilidad uterina espontánea. La preparación del tracto reproductivo exhibió una alta motilidad en los paneles A y C en ausencia de epinefrina. Pero este fenotipo está inactivo en el panel B con la presencia de un micro muller epinefrina.
Aquí, se muestra un análisis de datos de muestra de la administración de epinefrina y la recuperación espontánea de motilidad, que ilustra cómo los efectos de la hormona en la motilidad espontánea del tracto reproductivo se pueden cuantificar a partir de las grabaciones del tejido tomado antes, durante y después del tratamiento compuesto de prueba. Es importante evitar comprimir o estirar demasiado los cuernos uterinos de lo contrario no se observará contractilidad espontánea. Nuestro método también se puede utilizar para probar compuestos que pueden aumentar la contractilidad del útero.
Este procedimiento se puede aplicar a los ratón embarazadas uteri en las primeras etapas del embarazo. Este experimento tiene el potencial de actualizarse a un formato de placa de seis pozos para el cribado de fármacos de rendimiento.
