Name: assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus
Uploaded: 2015-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
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The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

Todos los procedimientos analizados en este manuscrito están en conformidad con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido y son aprobados por el Panel de Revisión Ética de Cambridge. 1. Recolección de Muestras <ol><li> Establecer apareamientos programados utilizando 8-12 semanas de edad Hembra C57BL / 6 ratones machos adultos (hasta 2 hembras por macho) en la tarde. Verificar la presencia de tapones vaginales como un signo de la cópula temprano en la mañana en los siguientes días. La presencia de un tapón en el gd0.5 marcas mañana. </li><li> En gd9.5, la eutanasia a los animales por dislocación cervical y abrir la cavidad abdominal. Tenga en cuenta que la eutanasia por el CO 2 puede causar vasodilatación. </li><li> Use hilo dental para ligar suavemente las arterias uterinas (Figura 1, flechas discontinuas). Atar el hilo alrededor de las arterias en la punta de cada cuerno uterino, proximal a los ovarios, así como alrededor del cuello uterino. Nota: No romper los vasos ya que esto puede resultar en arterias colapsadas. </li> &lt;li&gt; diseccionar el útero rápidamente usando tijeras de disección, la escisión de todo el útero distalmente a los tres puntos de ligadura en la punta de los cuernos uterinos y el cuello uterino. </li><li> Coloque el útero en un trozo de poliestireno preparan de modo que ambos cuernos están alineados a lo largo del mismo eje largo en direcciones opuestas desde el cuello uterino. Suavemente estire y el pin en su lugar con 2-3 25 G agujas. </li><li> Sumergir el poliestireno en un tubo cónico de 50 ml preparado. Arriba hasta 50 ml con 10% de formalina. Arreglo para 6.5 horas a temperatura ambiente. </li><li> Deseche la solución de formalina y reemplazar con 50 ml 1x tampón fosfato salino (PBS) durante 5 min. </li><li> Extirpar los dos cuernos uterinos proximal al punto de ligadura en cada extremo y proximal al cuello uterino en el centro, recortar cualquier exceso de grasa alrededor de los lugares de implantación y lavar dos veces en PBS durante 5 minutos para eliminar los restos de formol. </li><li> Almacene las muestras en etanol al 70% a los 4 ° C (hasta dos semanas) hasta su procesamiento. PRECAUCIÓN: Ethanol es altamente inflamable. </li><li> Utilice un sistema de procesamiento automatizado utilizando los parámetros indicados en la Tabla 1. Insertar los cuernos individualmente en parafina de modo que puedan ser cortados a lo largo del plano perpendicular al eje largo del útero. Esto asegura que el área máxima de cada sitio de implantación será expuesta para el análisis en el medio del bloque (Figura 2A). OPCIONAL: Este es un punto de tiempo conveniente para la aleatorización de los bloques si se desea. </li><li> El uso de un microtomo, cortar secciones de serie de 7 micras de espesor de los bloques. Mancha de una sección a cada intervalo de 49 m con hematoxilina y eosina (H &amp; E, ver sección 2.1). Almacenar las secciones restantes a temperatura ambiente para la tinción de SMA y otras aplicaciones posteriores. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Solución </td><td style="width:43px;"> Hora<html></td><td style="width:97px;"> La temperatura </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; Xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Ajustes para el procesamiento automatizado de tejido Visión general de la configuración utilizada para el procesamiento de tejido uterino 2. SterEvaluación eological <ol><li> H &amp; E tinción <ol><li> Desparafinar secciones por inmersión de diapositivas montadas en un bastidor de deslizamiento en un baño de xileno 100% durante 10 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El xileno es inflamable y un carcinógeno que es tóxico a través del contacto y la inhalación. Este trabajo debe llevarse a cabo en una campana de extracción, el uso de equipos de protección personal (EPP). </li><li> Sumergir los portaobjetos en el baño que contienen xileno limpio durante otros 10 min. </li><li> Secuencialmente sumergir los portaobjetos en baños que contienen etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70% y agua purificada durante 5 min cada uno. </li><li> Sumergir los portaobjetos en 50% Gill No solución de 3 hematoxilina, se diluyó con agua purificada, durante 5 min. PRECAUCIÓN: Hematoxilina es nocivo por ingestión y contacto con los ojos. Use PPE apropiado cuando maneje. </li><li> Lavar los portaobjetos en una cubeta de tinción con agua corriente durante 10 minutos. </li><li> Sumergir los portaobjetos en 1% solución de ácido / alcohol (ácido clorhídrico 10 M 1% en etanol al 70%) durante 10 sy lavar en una cubeta de tinción bajo el chorro de agua del grifo. </li><li> Sumergir los portaobjetos en solución de eosina durante 30 segundos y lavar en una cubeta de tinción con agua corriente durante 10 minutos. </li><li> Dentro de una campana de humos, secuencialmente sumergir los portaobjetos en baños que contienen etanol al 70%, etanol al 95% y etanol al 100% durante 5 min cada uno. </li><li> Sumergir los portaobjetos en baño que contiene xileno durante 10 minutos. </li><li> Monte cubreobjetos utilizando un medio de montaje a base de xileno. Secar horizontalmente y completamente en una campana de humos antes de la visualización de las diapositivas bajo un microscopio. </li></ol></li><li> Evaluación Estereológico del tamaño de los buques y las reformas de estado <ol><li> Para cada sitio de implantación, determinar qué secciones son cerca del punto medio sagital. El apego corioalantoica entre el feto y el desarrollo de la placenta sirve como un buen indicador del punto medio sagital. </li><li> Seleccione 3 secciones de 49 micras intervalos cerca del punto medio sagital para el análisis. Escanear diapositivas seleccionadas. A fin de evitar incvenas Luding, que han demostrado ser más periféricamente situado en los lugares de implantación 16, restringen el análisis en el centro de 2/4 de cada sitio de implantación (Figura 2). </li><li> Para evaluar el tamaño del lumen, dibujar por el interior de los vasos y registrar el área de esta forma. Para el tamaño total de la embarcación, dibujar alrededor de la pared exterior del recipiente, incluyendo las células endoteliales, pericitos y leucocitos intramurales. Nota: La relación del tamaño total buque lumen es un proxy para el estado de la remodelación de un buque. Como los vasos bobina a través del plano que la sección se corta a lo largo, puede haber múltiples secciones transversales de la misma arteria en una diapositiva. Evite la medición de la misma arteria varias veces. </li><li> Registre las mediciones de los 5 buques en cada sitio de implantación con los lúmenes más grandes y redondos. Mida cada sitio de implantación por triplicado (tres secciones espaciadas 49 m uno de otro). La media de estos 15 mediciones represeNTS el diámetro medio de los vasos más grandes. </li><li> Para evitar la sobrerrepresentación de los buques más grandes en algunas muestras, medir el mismo número de barcos en cada lugar de implantación. </li></ol></li></ol> 3. Evaluación cualitativa mediante inmunohistoquímica <ol><li> Desparafinización y rehidratación <ol><li> Desparafinar secciones por inmersión de diapositivas montadas en un bastidor de deslizamiento resistente al calor en un baño de xileno 100% durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Sumergir los portaobjetos en el baño que contienen xileno limpio durante otros 10 min. </li><li> Secuencialmente sumergir los portaobjetos en baños que contienen etanol al 100%, etanol al 95% y 70% y agua purificada durante 5 min cada uno. </li></ol></li><li> Antígeno recuperación <ol><li> Preparar un 10 mM de tampón de citrato de sodio en agua purificada y se ajusta a pH 6 con ácido clorhídrico 10 M. </li><li> Llenar un recipiente resistente al calor que puede contener 600 ml con tampón citrato 400 ml de sodio y colocar en una olla a presión doméstica que contiene suficiente water sumergir medio del recipiente. Monte la tapa de la olla a presión y el calor hasta que hierva. </li><li> Place parrilla corrediza en el tampón de citrato de sodio y fijar firmemente la tapa de la olla a presión. Una vez a presión, dejar hervir durante 3 minutos. </li><li> Despresurizar la olla a presión y retire el recipiente interior. Permitir que las diapositivas se enfríen en el tampón de citrato de sodio durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos en un baño que contiene agua purificada durante 5 min. </li><li> Rodear la secciones usando una barrera hidrofóbica pluma. </li><li> Lave las diapositivas sumergiendo en PBS durante 5 min. </li></ol></li><li> El bloqueo de la peroxidasa endógena y la unión no específica <ol><li> Incubar las secciones con 3% de peróxido de hidrógeno diluido en agua purificada en una cámara húmeda durante 30 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El peróxido de hidrógeno es altamente irritante para los ojos, la piel y por ingestión. Use PPE apropiado. </li><li> Toque fuera exceso de solución de peróxido de hidrógeno y lavar slides dos veces por inmersión en solución salina tamponada con Tris (TBS) durante 2 min cada una. </li><li> Incubar las secciones con inmunoglobulina de ratón reactivo de bloqueo del ratón en kit ratón preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces en TBS durante 2 minutos cada uno. </li></ol></li><li> Inmunodetección de actina de músculo liso <ol><li> Preparar la solución diluyente de anticuerpos (proporcionado en el kit) y se incuba con las secciones durante 5 min a temperatura ambiente, o de acuerdo a las instrucciones del fabricante. </li><li> Diluir 1: 100 actina de músculo liso de ratón anti-humano (DAKO M0851) en solución diluyente de anticuerpo. Diluir control de isotipo IgG2a de ratón en solución diluyente de anticuerpo, asegurando que la concentración de inmunoglobulina final es equivalente en ambas soluciones. </li><li> Toque de solución diluyente de anticuerpos y la cubierta secciones exceso, ya sea con diluidas soluciones de control de anticuerpos o isotipo. Incubar en una cámara humidificada durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces en TBS durante2 min cada uno. </li><li> Diluir anti-ratón biotinilado anticuerpo secundario e incubar las secciones durante 10 min a temperatura ambiente, o de acuerdo a las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar los portaobjetos una vez con TBS y PBS durante 2 min, respectivamente. </li><li> Preparar 3,3&#39;-diaminobencidina (DAB) solución de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cubrir las secciones con solución DAB e incubar durante un máximo de 4 minutos, asegurando para monitorear secciones para evitar el desarrollo de exceso de color. PRECAUCIÓN: DAB es inflamable y un posible carcinógeno que es tóxico a través del contacto y la inhalación. Use PPE apropiado cuando maneje. </li><li> Sumergir los portaobjetos en agua purificada una vez que se alcanza la intensidad de la tinción deseada. </li><li> De contraste con el 50% Gill Nº 3 hematoxilina durante 20 segundos y lavar en una cubeta de tinción bajo el chorro de agua del grifo hasta que el agua salga clara. </li></ol></li><li> La deshidratación y de montaje <ol><li> Dentro de una campana de humos, secuencialmente sumerja diapositivas en baños que contienen 70% ethanol, etanol 95% y etanol al 100% durante 5 min cada uno. </li><li> Sumergir los portaobjetos en baño que contiene xileno durante 10 minutos. </li><li> Monte cubreobjetos utilizando un medio de montaje a base de xileno. Secar horizontalmente y completamente en una campana de humos antes de la visualización de las diapositivas bajo un microscopio </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El protocolo que aquí se presenta está diseñado para proporcionar un método reproducible mediante el cual evaluar los cambios vasculares que son necesarias para un embarazo exitoso. Crítico para el éxito de esta evaluación es la calidad de las secciones de tejido. Tanto determinar con precisión la edad gestacional de los lugares de implantación, así como la ligadura de forma fiable las arterias uterinas son pasos cruciales. Los cambios en parámetros tales como el tiempo de la fijación, el protocolo de procesamiento de tejido, etc. también pueden afectar el resultado. Para una evaluación imparcial estereológicos, es importante para medir el mismo número de vasos en cada sitio de implantación. Se recomienda para medir 5 vasos por sitio de implantación y cada sitio de implantación por triplicado. La media de estos 15 mediciones representa el tamaño medio de los 5 buques más grandes. En relación con los datos de Rag2 alymphoid - / - IL2RG - / - ratones muestran aquí, encontramos este protocol útil para una serie de modelos de la función inmune materna inadecuada, incluyendo una de las células NK inhibidos 14. Los defectos en la remodelación arterial también se han demostrado en modelos de invasión trofoblástica deteriorado 18 y las técnicas descritas aquí pueden ser útiles para evaluar la vasculatura en estos casos. Hemos optimizado y validado este protocolo para la investigación de la remodelación vascular decidual en mitad de la gestación en el ratón, pero también es concebible para adaptar este protocolo para trabajar en otros sistemas modelo (por ejemplo, ratas) o incluso en otros órganos. Aunque nos encontramos con que la remodelación NK-dependiente puede ser evaluado con firmeza en gd9.5, puede ser modificado para otros puntos de tiempo como gd12.5, cuando la vasculatura materna está completamente remodelado. En este punto de tiempo, la invasión del trofoblasto endovascular es más profunda 16 y este punto de tiempo puede ser más adecuado para las investigaciones sobre el papel del trofoblasto para cambios vasculares. Si se desean lecturas cuantitativas adicionales,los investigadores también pueden aumentar el número de secciones teñidas para evaluar la SMA y porcentaje de vasos parcialmente remodeladas dentro de cada sitio de implantación. Una limitación de este protocolo es la naturaleza descriptiva de los exámenes histológicos. Los ensayos funcionales, sin embargo, sólo están convirtiendo lentamente disponibles (tales como ultrasonido Doppler 19). Estas técnicas requieren conocimientos técnicos y gastos mucho más altos para la adquisición y mantenimiento de los equipos, pero tienen la ventaja de proporcionar una lectura longitudinal en vivo para el efecto de los cambios que se pueden observar histológicamente. Un posible inconveniente de todos los exámenes estereológicas es la subjetividad de los investigadores. Para ello, el uso de dos examinadores independientes que analizan todas las muestras de forma independiente puede ayudar a evitar este problema. Mientras que el protocolo descrito aquí da una idea de la cantidad de sangre puede alcanzar la interfaz feto-materna, puede ser ventajoso combinar con el complenfoque ementary de evaluar la cantidad total de sangre en un momento dado en el sistema vascular a través del plástico arroja 16. La fuerza de este protocolo es que combina dos enfoques independientes. Cambio vascular se evaluó por primera cuantitativamente estereología y el resultado es entonces validado cualitativamente mediante inmunohistoquímica. La fiabilidad de los resultados puede ser reforzada por aleatorización de las muestras. Las muestras preparadas para este protocolo se puede utilizar fácilmente para investigar también otros parámetros del embarazo como decidualización, el desarrollo del agregado linfoide mesometrial del embarazo (MLAP) o inmunodetección de células de interés, para evaluar rigurosamente un fenotipo de embarazo en mitad de la gestación. Remodelación arterial es un paso crítico para los embarazos sin complicaciones en las mujeres y la falta de estos cambios sustenta los grandes síndromes obstétricos (GOS), a saber, la preeclampsia, restricción del crecimiento fetal ynacimiento de un niño muerto. Presentamos aquí las técnicas para evaluar cuidadosamente un fenotipo embarazo en modelos de ratón que imitan algunas características de la fisiopatología de la SMO.

El intercambio de nutrientes, gases y productos de desecho durante la gestación eutherian está mediada por la placenta. En el tracto reproductor femenino, las arterias uterinas son los principales conductos de sangre al útero. Después de la implantación, éstas se ramifican en vasos especializadas llamadas arterias espirales que se enroscan a través de los decidua basal hacia la unidad fetoplacentaria. Diámetro y la elasticidad de estas arterias espirales, que están rodeados por los leucocitos, en particular células natural killer uterina (unk), dictan volumen y la velocidad de la sangre a disposición de la placenta 1,2. Alteraciones hemodinámicas correctas como resultado de la remodelación de las arterias espirales son críticos para el éxito del embarazo. Si bien los mecanismos subyacentes difieren en detalle entre el ser humano y el embarazo murino, el resultado final del proceso de remodelación en ambas especies se dilata, de alta conductancia de la vasculatura que pierde su capa de músculo liso. En ratones, UNK interferón derivado de células (SIN-) γ es necesaria para inducir estos cambios en torno a mediados de la gestación 3-5. Los ratones que carecen de cualquiera de las células NK o componentes de la vía de señalización de IFN-γ dejar de someterse a estos cambios y esto se asocia con una reducción de 6,7 el crecimiento fetal, haciendo hincapié en la importancia de un adecuado suministro de sangre a la unidad fetoplacentaria. Durante el embarazo humano temprano, la invasión intersticial y endovascular de trofoblasto extravelloso y su interacción con las células unk son importantes para la inducción de cambios vasculares y promover el crecimiento fetal 8-10. células unk pueden orquestar la invasión del trofoblasto humano a través de quimiocinas y citocinas 11 tales como granulocitos y macrófagos - factor estimulante de colonias (GM-CSF) 12. Invasión trofoblasto superficial se asocia con la remodelación arterial y complicaciones del embarazo reducidas tales como la preeclampsia 9. Este protocolo se basa en el trabajo pionero de Anne Croy quien describió el importantepapel del sistema inmune y en particular derivados de IFN-γ NK para la remodelación vascular a través de inmunohistoquímica éxito y transferencia elegante experimentos 5,13. Aquí se describe un modo rápido y económico para evaluar el estado remodelación de arterias espirales. Aunque nuestro laboratorio evalúa rutinariamente esto en mitad de la gestación (días de gestación (gd) 9.5) 14, el proceso de remodelación tiene lugar entre gd8.5 y 12.5 15. La llegada de los escáneres de diapositivas automáticas ha facilitado en gran medida la evaluación de las áreas de los vasos y de lumen de secciones y descubrimos que se trata de un enfoque más reproducible que la medición de diámetros de los vasos. La adición de detección inmunohistoquímica de SMA permite una sencilla validación de los resultados obtenidos de la evaluación estereológicos. Al igual que con todas las técnicas estereológicos, se recomienda llevar a cabo la evaluación como un experimento ciego por al menos dos examinadores. Con este fin, un paso aleatorización puede ser introducido cuando se corta en serieting las muestras para que los investigadores que evalúan las diapositivas no saben de qué grupo experimental las muestras provienen. El objetivo general de este protocolo es proporcionar una herramienta fiable para evaluar cuidadosamente la remodelación de las arterias espirales en ratones con genotipos maternos y paternos definidos, en el contexto de modelos de ratón de complicaciones relacionadas con el embarazo. Los resultados subrayan la dependencia de las células UNK de este proceso, que es esencial para el crecimiento normal del feto.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental floss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene</td><td></td><td></td><td>Used for holding tissue in place</td></tr><tr><td>Straight dissection scissors</td><td>EMS</td><td>72940</td><td></td></tr><tr><td>25 G needles</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>300600</td><td>Used for holding tissue in place</td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma</td><td>327204-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0250/17</td><td></td></tr><tr><td>Automated tissue processor</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Slide rack</td><td>Sigma</td><td>Z710989</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Sigma</td><td>S5891</td><td></td></tr><tr><td>Purified water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin solution, Gill No. 3</td><td>Sigma</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution</td><td>Sigma</td><td>HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene-based mounting media</td><td>VWR</td><td>361254D</td><td></td></tr><tr><td>Slide scanner</td><td>Hamamatsu</td><td>NanoZoomer</td><td></td></tr><tr><td>Slide scanner software</td><td>Hamamatsu</td><td>NDP viewer</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>32320</td><td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td></tr><tr><td>Pressure cooker</td><td></td><td></td><td>Used for antigen retrieval</td></tr><tr><td>Heating plate</td><td></td><td></td><td>Used for antigen retrieval</td></tr><tr><td>Hydrophobic barrier pen</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1800/15</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffered saline</td><td>Sigma</td><td>T6664-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Mouse on mouse kit</td><td>Vector</td><td>BMK-2202</td><td>Significantly reduces background</td></tr><tr><td>Mouse anti-human smooth muscle actin</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td>Cross-reacts with mouse</td></tr><tr><td>IgG2a isotype control</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td></td></tr><tr><td>Humidified chamber</td><td>Sigma</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-Diaminobenzidine solution</td><td>Sigma</td><td>D4293-5SET</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1050/PB17</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

Rag2 - / - IL2RG - / - ratones carecen de todos los linfocitos maduros, incluyendo células NK 17, y sus arterias uterinas fallan a someterse a los cambios vasculares observadas en wildtype congenic C57BL / 6 (WT) ratones alrededor mitad de la gestación 5,14. Como resultado de esta reducción de la remodelación Rag2 - / - IL2RG - / - ratones muestran áreas luminales superficiales significativamente menores, indicativas de los vasos más pequeños en general que puede visualizarse en secciones teñidas con H y E y cuantificadas estereológicamente (Figura 2). Además, el espesor relativo de la pared (vaso a la proporción de lumen) es mayor en las arterias espirales en estos ratones, lo que sugiere reducida suministro de sangre y mayor velocidad de la sangre. Esta evaluación cuantitativa fue confirmada mediante la detección inmunohistoquímica de SMA. Es característico para los ratones WT para pierden la mayor parte de la SMA dentro de los medios vascularde las arterias espirales por mitad de la gestación. Si este proceso celular impulsada por NK no tiene lugar, SMA permanece en los medios de comunicación de los vasos y puede ser fácilmente detectado inmunohistoquímicamente como anillos alrededor de los vasos sanguíneos (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Figura 1: Ratón útero al gd9.5, resumen esquemático dibujo que muestra las posiciones relativas de los cuernos uterinos, cérvix (azul) y de las principales arterias uterinas (rojo).. Indicado son el eje largo de los cuernos uterinos (flechas) y los puntos de ligadura (flechas discontinuas). Las secciones para inmunohistoquímica se cortan a lo largo del plano de la vista. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Figura 2:. Estereológico evaluación de la remodelación arterial en mitad de la gestación (A) Ejemplo assessment de luminal y áreas totales de los vasos en secciones H &amp; E manchadas de hembras WT en el centro de 2/4 de la decidua basal (delimitada por el negro vertical de líneas discontinuas) en gd9.5. En los buques en el mayor aumento, el rojo línea discontinua demarca área del vaso total línea discontinua amarilla demarca área de la luz. Bar = 500 micras (izquierda), 50 m (derecha). El eje largo del útero es una línea horizontal en esta orientación. (B) Cuantificación de las áreas luminales (panel izquierdo) y relación del área luminal a la superficie total del buque (panel derecho) de WT (ratones C57BL / 6) y Rag2 - / - IL2RG - / - ratones (en C57BL / 6 de fondo). Cada punto de datos representa la media de 15 mediciones (5 mediciones por sección, 3 secciones por lugar de implantación). Bares representan la media de n = 11-13 sitios de implantación a partir de 4 embarazos por cada grupo; p-valor de una, no apareado prueba de Mann-Whitney de dos colas. WT: de tipo salvaje. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3:. La detección inmunohistoquímica de la actina de músculo liso en la decidua basal tinción Representante SMA en WT (arriba) y Rag2 - / - IL2RG - ratones (en C57BL / 6 antecedentes, abajo) en gd9.5 - /. Bar = 100 micras. WT: de tipo salvaje.

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Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Evaluación del Materno remodelado vascular durante el embarazo en el útero de ratón

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.2K vistas.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Video: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. Its unique anatomy makes the spinotrapezius useful for investigation of ischemic injury and subsequent microvascular remodeling. Here, we demonstrate an arteriolar ligation model in the murine spinotrapezius muscle that was developed by our research team and previously published1-3. For certain vulnerable mouse strains, such as the Balb/c mouse, this ligation surgery reliably creates skeletal muscle ischemia and serves as a platform for investigating therapies that stimulate revascularization. Methods of assessment are also demonstrated, including the use of intravital and confocal microscopy. The spinotrapezius is well suited to such imaging studies due to its accessibility (superficial dorsal anatomy) and relative thinness (60-200 &mu;m). The spinotrapezius muscle can be mounted en face, facilitating imaging of whole-muscle microvascular networks without histological sectioning. We describe the use of intravital microscopy to acquire metrics following a functional vasodilation procedure; specifically, the increase in arterilar diameter as a result of muscle contraction. We also demonstrate the procedures for harvesting and fixing the tissues, a necessary precursor to immunostaining studies and the use of confocal microscopy.

We demonstrate a novel arterial ligation model in murine spinotrapezius muscle, including a step-by-step procedure and description of required instrumentation. We describe the surgery and relevant outcome measurements relating to vascular network remodeling and functional vasodilation using intravital and confocal microscopy.

Modelo murino Spinotrapezius para evaluar el impacto de la ligadura arteriolar en la función microvascular y Remodelación

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

Investigación

Medicina

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Un nuevo uso de la ecografía tridimensional de alta frecuencia para la caracterización de embarazo temprano en el ratón

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Biología del Desarrollo

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Proyección de imagen usando un sistema del ultrasonido de alta frecuencia (30 / 45MHZ) Cardiovascular fetal ratón

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

Ultrasonido de alta frecuencia para el análisis del desarrollo Fetal y placentario en Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Is My Mouse Pregnant? High-Frequency Ultrasound Assessment

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant mice to determine evolving processes at various timepoints. Moreover, optimal and efficient breeding of model mice requires an assessment of timed pregnancies. Most commonly, mice are mated overnight, and the presence of a vaginal plug is determined; however, the positive predictive value of this technique is suboptimal, and one needs to wait to know if the mouse is truly pregnant. High-resolution ultrasound biomicroscopy is an effective and efficient tool for imaging: 1) Whether a mouse is pregnant; 2) What gestational stage the mouse has reached; and 3) Whether there are intrauterine losses. In addition to the embryos and fetuses, the investigator must also recognize common artifacts in the abdominal cavity so as not to mistake these for a gravid uterus. This article provides a protocol for imaging along with illustrative examples.

High-resolution ultrasound can help streamline experiments requiring timed-pregnant mice by determining the state of pregnancy, gestational age, and pregnancy losses. Presented here is a protocol to illustrate methods to assess mouse pregnancies as well as potential pitfalls (image artifacts) that may mimic pregnancy.

¿Está mi ratón embarazada? Evaluación de ultrasonido de alta frecuencia

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant ...

Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation and placenta formation and enable ongoing pregnancy. The limitations to pregnancy success caused by embryonic defects are well known and have been largely overcome in recent decades with the rise of in vitro fertilization (IVF) and assisted reproductive technologies. As yet, however, the field has not overcome the limitations caused by an inadequately receptive endometrium, thus resulting in stagnating IVF success rates. Ovarian and endometrial functions are closely intertwined, as hormones produced by the ovary are responsible for the endometrium's menstrual cyclicity. As such, when using rodent models of pregnancy, it can be difficult to ascertain whether an observed result is due to an ovarian or uterine deficit. To overcome this, an ovariectomized mouse model was developed with embryo transfer or artificial decidualization to allow the study of uterine-specific contributions to pregnancy. This article will provide instructions on how to perform ovariectomy and offer insights into various techniques for supplying exogenous hormones to support successful artificial decidualization or pregnancy following embryo transfer from healthy donors. These techniques include subcutaneous injection, slow-release pellets, and osmotic mini pumps. The key advantages and disadvantages of each method will be discussed, enabling researchers to choose the best study design for their specific research question.

Pregnancy establishment is a dynamic process involving complex embryo and uterine crosstalk. The precise contributions of the maternal uterine environment to these processes remain an active area of investigation. Here, detailed protocols are provided to aid in designing in vivo animal models to address these research questions.

Métodos para estudiar las contribuciones uterinas al establecimiento del embarazo en un modelo de ratón ovariectomizado

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Un modelo de rata de hipoperfusión leve intrauterina con microcoil de transcatheter estenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Neurociencias

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in reproductive medicine. In the past, the study of reproductive system development in rodents has been based on one-time histological examination of excised tissues. Recently, with the development of high-resolution transabdominal ultrasound, high-quality sonography can now be performed to evaluate the reproductive organs of rats, allowing a new method for studying the reproductive system. Images were obtained using a high-resolution ultrasonographic system. Gynecological ultrasonography was performed on 28 eight-week-old non-pregnant rats and 5 pregnant Sprague-Dawley rats. We describe how to recognize organs of the reproductive system and associated structures in typical views during different phases of the estrus cycle. Color flow Doppler was used to measure uterine artery blood flow and evaluate uterine blood flow pattern changes during different stages of pregnancy. We have demonstrated that ultrasound exploration is a useful method for evaluating changes in internal reproductive organs. Its use raises the possibility of conducting additional experiments, including medical or surgical procedures, and provides the ability to monitor sonographic changes to internal organs without sacrificing animals.

This manuscript describes the utility of ultrasound performed on female rats to design experimental models for reproductive and gynecological investigation. A step-by-step explanation of how to perform ultrasonographic evaluation is shown.

Ultrasonografía en las investigaciones de reproducción Experimental en ratas

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, gliosis&#160;and a progressive change in vascular function and structure. Although the onset of the retinopathies is characterized by subtle disturbances in visual perception, the modifications in the vascular plexus are the first signs detected by clinicians. The absence or presence of neovascularization determines whether the retinopathy is classified as either non-proliferative (NPDR) or proliferative (PDR). In this sense, several animal models tried to mimic specific vascular features of each stage to determine the underlying mechanisms involved in endothelium alterations, neuronal death and other events taking place in the retina. In this article, we will provide a complete description of the procedures required for the measurement of retinal vascular parameters in adults and early birth mice at postnatal day (P)17. We will detail the protocols to carry out retinal vascular staining with Isolectin GSA-IB4 in whole mounts for later microscopic visualization. Key steps for image processing with Image J Fiji software are also provided, therefore, the readers will be able to measure vessel density, diameter and tortuosity, vascular branching, as well as avascular and neovascular areas. These tools are highly helpful to evaluate and quantify vascular alterations in both non-proliferative and proliferative retinopathies.

This article describes a well-established and reproducible lectin stain assay for the whole mount retinal preparations and the protocols required for the quantitative measurement of vascular parameters frequently altered in proliferative and non-proliferative retinopathies.

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Development of a Murine Model for Femoral Artery Anastomotic Stenosis

In vascular surgery, vascular anastomosis is a common reconstructive technique used to restore blood flow. However, anastomotic restenosis is a frequent postoperative complication, primarily caused by surgery-induced vascular injury, intimal hyperplasia, and inflammatory responses. The mouse femoral artery anastomosis model is widely used to investigate the mechanisms of anastomotic restenosis and vascular repair. Microscopically guided end-to-end femoral artery anastomosis allows precise simulation of vascular injury and repair processes following surgery, providing a reliable experimental tool for studying the pathological mechanisms related to restenosis. This study focuses on refining the surgical technique for femoral artery anastomosis in mice. Through refinements in surgical techniques and optimization of technical details, we have achieved a marked increase in the success rate and reproducibility of the model. Specific improvements include refined vascular handling techniques during surgery, the selection of suture materials, and the optimization of suturing methods to minimize anastomotic leakage and postoperative occlusion. The study also emphasizes the observation of intimal hyperplasia, vascular remodeling at the anastomotic site, and long-term vessel patency. Through this research, we provide a concise and efficient operational guide for performing mouse femoral artery anastomosis, offering reliable technical support for experimental studies in vascular surgery. This work lays a solid foundation for subsequent investigations into related mechanisms and evaluations of therapeutic intervention.

Here we present a murine model for femoral artery anastomosis, offering researchers a valuable animal model to study and simulate vascular anastomotic stenosis. This development is crucial for advancing our understanding of the pathophysiology underlying this condition and facilitating more accurate and effective research into vascular diseases.

Desarrollo de un modelo murino para la estenosis anastomótica de la arteria femoral

In vascular surgery, vascular anastomosis is a common reconstructive technique used to restore blood flow. However, anastomotic restenosis is a frequent ...