The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

Todos los procedimientos analizados en este manuscrito están en conformidad con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido y son aprobados por el Panel de Revisión Ética de Cambridge. 1. Recolección de Muestras <ol><li> Establecer apareamientos programados utilizando 8-12 semanas de edad Hembra C57BL / 6 ratones machos adultos (hasta 2 hembras por macho) en la tarde. Verificar la presencia de tapones vaginales como un signo de la cópula temprano en la mañana en los siguientes días. La presencia de un tapón en el gd0.5 marcas mañana. </li><li> En gd9.5, la eutanasia a los animales por dislocación cervical y abrir la cavidad abdominal. Tenga en cuenta que la eutanasia por el CO 2 puede causar vasodilatación. </li><li> Use hilo dental para ligar suavemente las arterias uterinas (Figura 1, flechas discontinuas). Atar el hilo alrededor de las arterias en la punta de cada cuerno uterino, proximal a los ovarios, así como alrededor del cuello uterino. Nota: No romper los vasos ya que esto puede resultar en arterias colapsadas. </li> &lt;li&gt; diseccionar el útero rápidamente usando tijeras de disección, la escisión de todo el útero distalmente a los tres puntos de ligadura en la punta de los cuernos uterinos y el cuello uterino. </li><li> Coloque el útero en un trozo de poliestireno preparan de modo que ambos cuernos están alineados a lo largo del mismo eje largo en direcciones opuestas desde el cuello uterino. Suavemente estire y el pin en su lugar con 2-3 25 G agujas. </li><li> Sumergir el poliestireno en un tubo cónico de 50 ml preparado. Arriba hasta 50 ml con 10% de formalina. Arreglo para 6.5 horas a temperatura ambiente. </li><li> Deseche la solución de formalina y reemplazar con 50 ml 1x tampón fosfato salino (PBS) durante 5 min. </li><li> Extirpar los dos cuernos uterinos proximal al punto de ligadura en cada extremo y proximal al cuello uterino en el centro, recortar cualquier exceso de grasa alrededor de los lugares de implantación y lavar dos veces en PBS durante 5 minutos para eliminar los restos de formol. </li><li> Almacene las muestras en etanol al 70% a los 4 ° C (hasta dos semanas) hasta su procesamiento. PRECAUCIÓN: Ethanol es altamente inflamable. </li><li> Utilice un sistema de procesamiento automatizado utilizando los parámetros indicados en la Tabla 1. Insertar los cuernos individualmente en parafina de modo que puedan ser cortados a lo largo del plano perpendicular al eje largo del útero. Esto asegura que el área máxima de cada sitio de implantación será expuesta para el análisis en el medio del bloque (Figura 2A). OPCIONAL: Este es un punto de tiempo conveniente para la aleatorización de los bloques si se desea. </li><li> El uso de un microtomo, cortar secciones de serie de 7 micras de espesor de los bloques. Mancha de una sección a cada intervalo de 49 m con hematoxilina y eosina (H &amp; E, ver sección 2.1). Almacenar las secciones restantes a temperatura ambiente para la tinción de SMA y otras aplicaciones posteriores. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Solución </td><td style="width:43px;"> Hora<html></td><td style="width:97px;"> La temperatura </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; Xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Ajustes para el procesamiento automatizado de tejido Visión general de la configuración utilizada para el procesamiento de tejido uterino 2. SterEvaluación eological <ol><li> H &amp; E tinción <ol><li> Desparafinar secciones por inmersión de diapositivas montadas en un bastidor de deslizamiento en un baño de xileno 100% durante 10 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El xileno es inflamable y un carcinógeno que es tóxico a través del contacto y la inhalación. Este trabajo debe llevarse a cabo en una campana de extracción, el uso de equipos de protección personal (EPP). </li><li> Sumergir los portaobjetos en el baño que contienen xileno limpio durante otros 10 min. </li><li> Secuencialmente sumergir los portaobjetos en baños que contienen etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70% y agua purificada durante 5 min cada uno. </li><li> Sumergir los portaobjetos en 50% Gill No solución de 3 hematoxilina, se diluyó con agua purificada, durante 5 min. PRECAUCIÓN: Hematoxilina es nocivo por ingestión y contacto con los ojos. Use PPE apropiado cuando maneje. </li><li> Lavar los portaobjetos en una cubeta de tinción con agua corriente durante 10 minutos. </li><li> Sumergir los portaobjetos en 1% solución de ácido / alcohol (ácido clorhídrico 10 M 1% en etanol al 70%) durante 10 sy lavar en una cubeta de tinción bajo el chorro de agua del grifo. </li><li> Sumergir los portaobjetos en solución de eosina durante 30 segundos y lavar en una cubeta de tinción con agua corriente durante 10 minutos. </li><li> Dentro de una campana de humos, secuencialmente sumergir los portaobjetos en baños que contienen etanol al 70%, etanol al 95% y etanol al 100% durante 5 min cada uno. </li><li> Sumergir los portaobjetos en baño que contiene xileno durante 10 minutos. </li><li> Monte cubreobjetos utilizando un medio de montaje a base de xileno. Secar horizontalmente y completamente en una campana de humos antes de la visualización de las diapositivas bajo un microscopio. </li></ol></li><li> Evaluación Estereológico del tamaño de los buques y las reformas de estado <ol><li> Para cada sitio de implantación, determinar qué secciones son cerca del punto medio sagital. El apego corioalantoica entre el feto y el desarrollo de la placenta sirve como un buen indicador del punto medio sagital. </li><li> Seleccione 3 secciones de 49 micras intervalos cerca del punto medio sagital para el análisis. Escanear diapositivas seleccionadas. A fin de evitar incvenas Luding, que han demostrado ser más periféricamente situado en los lugares de implantación 16, restringen el análisis en el centro de 2/4 de cada sitio de implantación (Figura 2). </li><li> Para evaluar el tamaño del lumen, dibujar por el interior de los vasos y registrar el área de esta forma. Para el tamaño total de la embarcación, dibujar alrededor de la pared exterior del recipiente, incluyendo las células endoteliales, pericitos y leucocitos intramurales. Nota: La relación del tamaño total buque lumen es un proxy para el estado de la remodelación de un buque. Como los vasos bobina a través del plano que la sección se corta a lo largo, puede haber múltiples secciones transversales de la misma arteria en una diapositiva. Evite la medición de la misma arteria varias veces. </li><li> Registre las mediciones de los 5 buques en cada sitio de implantación con los lúmenes más grandes y redondos. Mida cada sitio de implantación por triplicado (tres secciones espaciadas 49 m uno de otro). La media de estos 15 mediciones represeNTS el diámetro medio de los vasos más grandes. </li><li> Para evitar la sobrerrepresentación de los buques más grandes en algunas muestras, medir el mismo número de barcos en cada lugar de implantación. </li></ol></li></ol> 3. Evaluación cualitativa mediante inmunohistoquímica <ol><li> Desparafinización y rehidratación <ol><li> Desparafinar secciones por inmersión de diapositivas montadas en un bastidor de deslizamiento resistente al calor en un baño de xileno 100% durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Sumergir los portaobjetos en el baño que contienen xileno limpio durante otros 10 min. </li><li> Secuencialmente sumergir los portaobjetos en baños que contienen etanol al 100%, etanol al 95% y 70% y agua purificada durante 5 min cada uno. </li></ol></li><li> Antígeno recuperación <ol><li> Preparar un 10 mM de tampón de citrato de sodio en agua purificada y se ajusta a pH 6 con ácido clorhídrico 10 M. </li><li> Llenar un recipiente resistente al calor que puede contener 600 ml con tampón citrato 400 ml de sodio y colocar en una olla a presión doméstica que contiene suficiente water sumergir medio del recipiente. Monte la tapa de la olla a presión y el calor hasta que hierva. </li><li> Place parrilla corrediza en el tampón de citrato de sodio y fijar firmemente la tapa de la olla a presión. Una vez a presión, dejar hervir durante 3 minutos. </li><li> Despresurizar la olla a presión y retire el recipiente interior. Permitir que las diapositivas se enfríen en el tampón de citrato de sodio durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos en un baño que contiene agua purificada durante 5 min. </li><li> Rodear la secciones usando una barrera hidrofóbica pluma. </li><li> Lave las diapositivas sumergiendo en PBS durante 5 min. </li></ol></li><li> El bloqueo de la peroxidasa endógena y la unión no específica <ol><li> Incubar las secciones con 3% de peróxido de hidrógeno diluido en agua purificada en una cámara húmeda durante 30 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El peróxido de hidrógeno es altamente irritante para los ojos, la piel y por ingestión. Use PPE apropiado. </li><li> Toque fuera exceso de solución de peróxido de hidrógeno y lavar slides dos veces por inmersión en solución salina tamponada con Tris (TBS) durante 2 min cada una. </li><li> Incubar las secciones con inmunoglobulina de ratón reactivo de bloqueo del ratón en kit ratón preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces en TBS durante 2 minutos cada uno. </li></ol></li><li> Inmunodetección de actina de músculo liso <ol><li> Preparar la solución diluyente de anticuerpos (proporcionado en el kit) y se incuba con las secciones durante 5 min a temperatura ambiente, o de acuerdo a las instrucciones del fabricante. </li><li> Diluir 1: 100 actina de músculo liso de ratón anti-humano (DAKO M0851) en solución diluyente de anticuerpo. Diluir control de isotipo IgG2a de ratón en solución diluyente de anticuerpo, asegurando que la concentración de inmunoglobulina final es equivalente en ambas soluciones. </li><li> Toque de solución diluyente de anticuerpos y la cubierta secciones exceso, ya sea con diluidas soluciones de control de anticuerpos o isotipo. Incubar en una cámara humidificada durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces en TBS durante2 min cada uno. </li><li> Diluir anti-ratón biotinilado anticuerpo secundario e incubar las secciones durante 10 min a temperatura ambiente, o de acuerdo a las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar los portaobjetos una vez con TBS y PBS durante 2 min, respectivamente. </li><li> Preparar 3,3&#39;-diaminobencidina (DAB) solución de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cubrir las secciones con solución DAB e incubar durante un máximo de 4 minutos, asegurando para monitorear secciones para evitar el desarrollo de exceso de color. PRECAUCIÓN: DAB es inflamable y un posible carcinógeno que es tóxico a través del contacto y la inhalación. Use PPE apropiado cuando maneje. </li><li> Sumergir los portaobjetos en agua purificada una vez que se alcanza la intensidad de la tinción deseada. </li><li> De contraste con el 50% Gill Nº 3 hematoxilina durante 20 segundos y lavar en una cubeta de tinción bajo el chorro de agua del grifo hasta que el agua salga clara. </li></ol></li><li> La deshidratación y de montaje <ol><li> Dentro de una campana de humos, secuencialmente sumerja diapositivas en baños que contienen 70% ethanol, etanol 95% y etanol al 100% durante 5 min cada uno. </li><li> Sumergir los portaobjetos en baño que contiene xileno durante 10 minutos. </li><li> Monte cubreobjetos utilizando un medio de montaje a base de xileno. Secar horizontalmente y completamente en una campana de humos antes de la visualización de las diapositivas bajo un microscopio </li></ol></li></ol>

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	<li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy.">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+spiral+arteries+in+human+pregnancy:+facts+and+controversies.">The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies.</a> Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+contributes+to+the+normalcy+of+murine+pregnancy.">Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy.</a> Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+uterine+natural+killer+cells+are+mediated+by+interferon+gamma+production+during+murine+pregnancy.">Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy.</a> Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).</li><li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification,+decidual+integrity,+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy.">Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).</li><li>Ashkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+requirements+for+IL-15+and+IFN+regulatory+factors+in+uterine+NK+cell+differentiation+and+function+during+pregnancy.">Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy.</a> J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).</li><li>Barber, E. M., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+NK+cell+population+requires+IL-15+but+these+cells+are+not+required+for+pregnancy+nor+the+resolution+of+a+Listeria+monocytogenes+infection.">The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).</li><li>Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+variability+of+immune+system+genes+affect+placentation.">How does variability of immune system genes affect placentation.</a> Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+placentation.">Deep placentation.</a> Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).</li><li>Colucci, F., Kieckbusch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+natural+killer+cells+nurture+fetal+growth:+in+medio+stat+virtus.">Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface.">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li><li>Xiong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+NK+cell-activating+receptor+KIR2DS1+enhances+placentation.">Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation.</a> J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).</li><li>Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice.">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).</li><li>Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC-dependent+inhibition+of+uterine+NK+cells+impedes+fetal+growth+and+decidual+vascular+remodelling.">MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell-triggered+vascular+transformation:+maternal+care+before+birth.">Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth.</a> Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).</li><li>Adamson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+trophoblast+cells+and+the+maternal+and+fetal+circulation+in+the+mouse+placenta.">Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).</li><li>Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+NK+cell+development+using+a+novel+alymphoid+mouse+model:+Investigating+the+role+of+the+c-abl+proto-oncogene+in+murine+NK+cell+differentiation.">Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation.</a> J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).</li><li>Hu, D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+Tpbpa-positive+trophoblast+precursors+leads+to+defects+in+maternal+spiral+artery+remodeling+in+the+mouse+placenta.">Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ultrasonography+to+Define+Fetal-Maternal+Relationships:+Moving+from+Humans+to+Mice.">Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice.</a> Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El protocolo que aquí se presenta está diseñado para proporcionar un método reproducible mediante el cual evaluar los cambios vasculares que son necesarias para un embarazo exitoso. Crítico para el éxito de esta evaluación es la calidad de las secciones de tejido. Tanto determinar con precisión la edad gestacional de los lugares de implantación, así como la ligadura de forma fiable las arterias uterinas son pasos cruciales. Los cambios en parámetros tales como el tiempo de la fijación, el protocolo de procesamiento de tejido, etc. también pueden afectar el resultado. Para una evaluación imparcial estereológicos, es importante para medir el mismo número de vasos en cada sitio de implantación. Se recomienda para medir 5 vasos por sitio de implantación y cada sitio de implantación por triplicado. La media de estos 15 mediciones representa el tamaño medio de los 5 buques más grandes. En relación con los datos de Rag2 alymphoid - / - IL2RG - / - ratones muestran aquí, encontramos este protocol útil para una serie de modelos de la función inmune materna inadecuada, incluyendo una de las células NK inhibidos 14. Los defectos en la remodelación arterial también se han demostrado en modelos de invasión trofoblástica deteriorado 18 y las técnicas descritas aquí pueden ser útiles para evaluar la vasculatura en estos casos. Hemos optimizado y validado este protocolo para la investigación de la remodelación vascular decidual en mitad de la gestación en el ratón, pero también es concebible para adaptar este protocolo para trabajar en otros sistemas modelo (por ejemplo, ratas) o incluso en otros órganos. Aunque nos encontramos con que la remodelación NK-dependiente puede ser evaluado con firmeza en gd9.5, puede ser modificado para otros puntos de tiempo como gd12.5, cuando la vasculatura materna está completamente remodelado. En este punto de tiempo, la invasión del trofoblasto endovascular es más profunda 16 y este punto de tiempo puede ser más adecuado para las investigaciones sobre el papel del trofoblasto para cambios vasculares. Si se desean lecturas cuantitativas adicionales,los investigadores también pueden aumentar el número de secciones teñidas para evaluar la SMA y porcentaje de vasos parcialmente remodeladas dentro de cada sitio de implantación. Una limitación de este protocolo es la naturaleza descriptiva de los exámenes histológicos. Los ensayos funcionales, sin embargo, sólo están convirtiendo lentamente disponibles (tales como ultrasonido Doppler 19). Estas técnicas requieren conocimientos técnicos y gastos mucho más altos para la adquisición y mantenimiento de los equipos, pero tienen la ventaja de proporcionar una lectura longitudinal en vivo para el efecto de los cambios que se pueden observar histológicamente. Un posible inconveniente de todos los exámenes estereológicas es la subjetividad de los investigadores. Para ello, el uso de dos examinadores independientes que analizan todas las muestras de forma independiente puede ayudar a evitar este problema. Mientras que el protocolo descrito aquí da una idea de la cantidad de sangre puede alcanzar la interfaz feto-materna, puede ser ventajoso combinar con el complenfoque ementary de evaluar la cantidad total de sangre en un momento dado en el sistema vascular a través del plástico arroja 16. La fuerza de este protocolo es que combina dos enfoques independientes. Cambio vascular se evaluó por primera cuantitativamente estereología y el resultado es entonces validado cualitativamente mediante inmunohistoquímica. La fiabilidad de los resultados puede ser reforzada por aleatorización de las muestras. Las muestras preparadas para este protocolo se puede utilizar fácilmente para investigar también otros parámetros del embarazo como decidualización, el desarrollo del agregado linfoide mesometrial del embarazo (MLAP) o inmunodetección de células de interés, para evaluar rigurosamente un fenotipo de embarazo en mitad de la gestación. Remodelación arterial es un paso crítico para los embarazos sin complicaciones en las mujeres y la falta de estos cambios sustenta los grandes síndromes obstétricos (GOS), a saber, la preeclampsia, restricción del crecimiento fetal ynacimiento de un niño muerto. Presentamos aquí las técnicas para evaluar cuidadosamente un fenotipo embarazo en modelos de ratón que imitan algunas características de la fisiopatología de la SMO.

El intercambio de nutrientes, gases y productos de desecho durante la gestación eutherian está mediada por la placenta. En el tracto reproductor femenino, las arterias uterinas son los principales conductos de sangre al útero. Después de la implantación, éstas se ramifican en vasos especializadas llamadas arterias espirales que se enroscan a través de los decidua basal hacia la unidad fetoplacentaria. Diámetro y la elasticidad de estas arterias espirales, que están rodeados por los leucocitos, en particular células natural killer uterina (unk), dictan volumen y la velocidad de la sangre a disposición de la placenta 1,2. Alteraciones hemodinámicas correctas como resultado de la remodelación de las arterias espirales son críticos para el éxito del embarazo. Si bien los mecanismos subyacentes difieren en detalle entre el ser humano y el embarazo murino, el resultado final del proceso de remodelación en ambas especies se dilata, de alta conductancia de la vasculatura que pierde su capa de músculo liso. En ratones, UNK interferón derivado de células (SIN-) γ es necesaria para inducir estos cambios en torno a mediados de la gestación 3-5. Los ratones que carecen de cualquiera de las células NK o componentes de la vía de señalización de IFN-γ dejar de someterse a estos cambios y esto se asocia con una reducción de 6,7 el crecimiento fetal, haciendo hincapié en la importancia de un adecuado suministro de sangre a la unidad fetoplacentaria. Durante el embarazo humano temprano, la invasión intersticial y endovascular de trofoblasto extravelloso y su interacción con las células unk son importantes para la inducción de cambios vasculares y promover el crecimiento fetal 8-10. células unk pueden orquestar la invasión del trofoblasto humano a través de quimiocinas y citocinas 11 tales como granulocitos y macrófagos - factor estimulante de colonias (GM-CSF) 12. Invasión trofoblasto superficial se asocia con la remodelación arterial y complicaciones del embarazo reducidas tales como la preeclampsia 9. Este protocolo se basa en el trabajo pionero de Anne Croy quien describió el importantepapel del sistema inmune y en particular derivados de IFN-γ NK para la remodelación vascular a través de inmunohistoquímica éxito y transferencia elegante experimentos 5,13. Aquí se describe un modo rápido y económico para evaluar el estado remodelación de arterias espirales. Aunque nuestro laboratorio evalúa rutinariamente esto en mitad de la gestación (días de gestación (gd) 9.5) 14, el proceso de remodelación tiene lugar entre gd8.5 y 12.5 15. La llegada de los escáneres de diapositivas automáticas ha facilitado en gran medida la evaluación de las áreas de los vasos y de lumen de secciones y descubrimos que se trata de un enfoque más reproducible que la medición de diámetros de los vasos. La adición de detección inmunohistoquímica de SMA permite una sencilla validación de los resultados obtenidos de la evaluación estereológicos. Al igual que con todas las técnicas estereológicos, se recomienda llevar a cabo la evaluación como un experimento ciego por al menos dos examinadores. Con este fin, un paso aleatorización puede ser introducido cuando se corta en serieting las muestras para que los investigadores que evalúan las diapositivas no saben de qué grupo experimental las muestras provienen. El objetivo general de este protocolo es proporcionar una herramienta fiable para evaluar cuidadosamente la remodelación de las arterias espirales en ratones con genotipos maternos y paternos definidos, en el contexto de modelos de ratón de complicaciones relacionadas con el embarazo. Los resultados subrayan la dependencia de las células UNK de este proceso, que es esencial para el crecimiento normal del feto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td>
			<td style="width:99px;">Charles River</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Dental floss</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Polystyrene</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Straight dissection scissors</td>
			<td style="width:99px;">EMS</td>
			<td style="width:111px;">72940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">25G needles</td>
			<td style="width:99px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:111px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Ethanol</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Paraffin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">327204-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Xylene</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">X/0250/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Automated tissue processor</td>
			<td style="width:99px;">Sakura</td>
			<td style="width:111px;">6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Microtome</td>
			<td style="width:99px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;">RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide rack</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">Z710989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S5891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Purified water</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hematoxylin solution, Gill No. 3</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">GHS332-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Eosin Y solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fume hood</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Xylene-based mounting media</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">361254D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NanoZoomer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner software</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NDP viewer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32320</td>
			<td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Pressure cooker</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Heating plate</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hydrophobic barrier pen</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1800/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Tris buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T6664-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mouse on mouse kit</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">BMK-2202</td>
			<td>Significantly reduces background</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Mouse anti-human smooth muscle actin</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">M0851</td>
			<td>Cross-reacts with mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">IgG2a isotype control</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">X0943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Humidified chamber</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H6644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">3,3&#8217;-Diaminobenzidine solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D4293-5SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1050/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

Rag2 - / - IL2RG - / - ratones carecen de todos los linfocitos maduros, incluyendo células NK 17, y sus arterias uterinas fallan a someterse a los cambios vasculares observadas en wildtype congenic C57BL / 6 (WT) ratones alrededor mitad de la gestación 5,14. Como resultado de esta reducción de la remodelación Rag2 - / - IL2RG - / - ratones muestran áreas luminales superficiales significativamente menores, indicativas de los vasos más pequeños en general que puede visualizarse en secciones teñidas con H y E y cuantificadas estereológicamente (Figura 2). Además, el espesor relativo de la pared (vaso a la proporción de lumen) es mayor en las arterias espirales en estos ratones, lo que sugiere reducida suministro de sangre y mayor velocidad de la sangre. Esta evaluación cuantitativa fue confirmada mediante la detección inmunohistoquímica de SMA. Es característico para los ratones WT para pierden la mayor parte de la SMA dentro de los medios vascularde las arterias espirales por mitad de la gestación. Si este proceso celular impulsada por NK no tiene lugar, SMA permanece en los medios de comunicación de los vasos y puede ser fácilmente detectado inmunohistoquímicamente como anillos alrededor de los vasos sanguíneos (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Figura 1: Ratón útero al gd9.5, resumen esquemático dibujo que muestra las posiciones relativas de los cuernos uterinos, cérvix (azul) y de las principales arterias uterinas (rojo).. Indicado son el eje largo de los cuernos uterinos (flechas) y los puntos de ligadura (flechas discontinuas). Las secciones para inmunohistoquímica se cortan a lo largo del plano de la vista. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Figura 2:. Estereológico evaluación de la remodelación arterial en mitad de la gestación (A) Ejemplo assessment de luminal y áreas totales de los vasos en secciones H &amp; E manchadas de hembras WT en el centro de 2/4 de la decidua basal (delimitada por el negro vertical de líneas discontinuas) en gd9.5. En los buques en el mayor aumento, el rojo línea discontinua demarca área del vaso total línea discontinua amarilla demarca área de la luz. Bar = 500 micras (izquierda), 50 m (derecha). El eje largo del útero es una línea horizontal en esta orientación. (B) Cuantificación de las áreas luminales (panel izquierdo) y relación del área luminal a la superficie total del buque (panel derecho) de WT (ratones C57BL / 6) y Rag2 - / - IL2RG - / - ratones (en C57BL / 6 de fondo). Cada punto de datos representa la media de 15 mediciones (5 mediciones por sección, 3 secciones por lugar de implantación). Bares representan la media de n = 11-13 sitios de implantación a partir de 4 embarazos por cada grupo; p-valor de una, no apareado prueba de Mann-Whitney de dos colas. WT: de tipo salvaje. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3:. La detección inmunohistoquímica de la actina de músculo liso en la decidua basal tinción Representante SMA en WT (arriba) y Rag2 - / - IL2RG - ratones (en C57BL / 6 antecedentes, abajo) en gd9.5 - /. Bar = 100 micras. WT: de tipo salvaje.

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Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Evaluación del Materno remodelado vascular durante el embarazo en el útero de ratón

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.2K vistas.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Video: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

La manipulación de genes maternos funcional de Productos que utilizan<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de ovocitos en el pez cebra

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Un nuevo uso de la ecografía tridimensional de alta frecuencia para la caracterización de embarazo temprano en el ratón

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Cultivo de tejido ovárico para visualizar fenómenos en ovario de ratón

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques are used, including serum chemistry, histological analysis, and immunostaining for specific markers. Although these techniques can provide important information about the biliary system, they often do not present a full picture of bile duct (BD) developmental defects across the whole liver. This is in part due to the robust ability of the mouse liver to drain the bile even in animals with significant impairment in biliary development. Here we present a simple method to calculate the average number of BDs associated with each portal vein (PV) in sections covering all lobes of mutant/transgenic mice. In this method, livers are mounted and sectioned in a stereotypic manner to facilitate comparison among various genotypes and experimental conditions. BDs are identified via light microscopy of cytokeratin-stained cholangiocytes, and then counted and divided by the total number of PVs present in liver section. As an example, we show how this method can clearly distinguish between wild-type mice and a mouse model of Alagille syndrome. The method presented here cannot substitute for techniques that visualize the three-dimensional structure of the biliary tree. However, it offers an easy and direct way to quantitatively assess BD development and the degree of ductular reaction formation in mice.

We present a rather simple and sensitive method for accurate quantification of bile duct density in the mouse liver. This method can aid in determining the effects of genetic and environmental modifiers and the effectiveness of potential therapies in mouse models of biliary diseases.

Determinación de la densidad del conducto biliar en el hígado del ratón

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Fundición vascular de pulmones de ratón postnatales tempranos y adultos para imágenes micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...