Este método proporciona una herramienta para que los científicos estudien los factores genéticos ambientales que afectan la migración y el comportamiento de los espermatozoides en sus entornos nativos dentro del tracto reproductivo femenino. La principal ventaja de esta técnica se deriva de la epidermis transparente de los C.elegans, que permite a los experimentadores visualizar y registrar fácilmente el movimiento de los espermatozoides en animales vivos. Para comenzar, utilice un pico de gusano hecho de una pipeta Pasteur y alambre de platino aplanado en un extremo para recoger hermafroditas de etapa de 20 a 30 L4, y colóquelas suavemente en una placa NGM de seis centímetros de semilla.
Incubar los hermafroditas a 20 grados centígrados durante 28 a 30 horas. A continuación, haga una placa de tinción masculina. Utilice el extremo de una varilla de agitación de vidrio para raspar E.coli del césped de las bacterias de una placa de semillas, y depositarlo en el centro de una placa NGM sin semillas, haciendo un punto de alimento de cinco a siete milímetros de diámetro.
Mezclar dos microlitros de mito-teñido de unlilalar en DMSO y 10 microlitros de tampón M9 en un tubo de microcentrífuga. Pipetear toda la solución mito-teñida en el punto de alimento en la placa de tinción masculina. Coloque la placa en la oscuridad para secarla durante 30 minutos.
Bajo un microscopio, en una placa que contiene C.elegans adultos de uno a tres días de edad, identifican a los machos por su cola en forma de abanico. Escoja aproximadamente 100 machos en el punto de alimento manchado de mito-teñido en la placa de tinción masculina. Envuelva la placa en papel de aluminio e incubar durante la noche a 16 grados centígrados.
En el segundo día, transfiera a los machos manchados a una nueva placa NGM de semillas para limpiar el exceso de bacterias manchadas de mito-teñido. Mantenga el plato en la oscuridad hasta el apareamiento. Para hacer una placa de acoplamiento, en una placa NGM sin semillas, gotee dos microlitros de mezcla gruesa de E.coli.
Espere aproximadamente de 10 a 15 minutos para que las bacterias gruesas se sequen para formar un punto de apareamiento. Mientras espera a que se seque la placa de acoplamiento, mezcle 300 microlitros de 1% de peso en tricaína volumen, 300 microlitros de 0.1% de peso por tetramisole de volumen y 900 microlitros de M9. Transfiera 600 microlitros de la solución de tetramisole/tricaína a un cristal de reloj. Transfiera de 12 a 15 hermafroditas recogidas en el primer día a la solución de tetramisole/tricaína en el cristal del reloj.
Coloque la mitad inferior de un plato de Petri sobre el vaso del reloj para mantenerlo cubierto de evaporación, e incubar durante 30 minutos para inmovilizar los hermafroditas. A continuación, recupere la placa NGM de semillas que contiene los machos manchados de la oscuridad, y elija de 50 a 60 machos manchados en el punto de acoplamiento seco en la placa de apareamiento. Guarde el plato en la oscuridad.
Después de que los hermafroditas se inmovilicen, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para recoger los hermafroditas inmovilizados del cristal del reloj. Evite chupar los hermafroditas más allá de la parte estrecha de la pipeta. Transfiera los hermafroditas a una placa NGM no sesgado.
Retire el mayor cantidad de líquido posible y deje que el exceso de líquido se seque. Tan pronto como todo el líquido visible se haya evaporado, transfiera los hermafroditas anestesiados al punto de apareamiento con los machos manchados. Incubar en la oscuridad durante 30 minutos para permitir el apareamiento.
Si se desea una evaluación de la distribución de espermatozoides, transfiera los hermafroditas acoplados a una placa NGM de semilla y déjelos descansar durante una hora antes del montaje para su visualización. Para montar gusanos para su visualización, primero gotee de 10 a 15 microlitros de la solución de tetramisole/tricaína en la almohadilla de agarosa preparada del 2%, y transfiera los hermafroditas acoplados a la solución de la almohadilla. Coloque un cubreobjetos sobre los gusanos.
Monte la diapositiva en un microscopio vertical equipado con epifluorescencia y coloque el gusano de modo que tanto la vulva como una espermatozoides estén a la vista. Enfoque la imagen centrándose en el centro de la espermatozoidesa. Compruebe la exposición de los canales DIC y TRITC.
En DIC, las estructuras internas de gusanos son claramente visibles. En TRITC, los espermatozoides individuales son visibles como puncta distinta. Adquiera imágenes de DIC y fluorescencia para cada útero.
Para capturar videos de lapso de tiempo, primero localice los hermafroditas que contienen espermatozoides etiquetados dentro del útero. En el panel Adquisición, ajuste los intervalos de adquisición de la imagen a 15 a 30 segundos y la duración a 10 a 20 minutos por útero. A continuación, haga clic en Ejecutar para adquirir imágenes de lapso de tiempo en canales DIC y TRITC.
Comenzando con la vulva en un extremo y la espermatozoides en el otro, divide el útero en tres zonas, con zona que contiene la vulva y la zona tres que contiene la espermatozoide. Cuente manualmente el número de espermatozoides dentro de cada tercio del útero e informe el número en cada zona como un porcentaje del total de espermatozoides en todo el útero. Si es necesario, utilice la tabla de búsqueda para ajustar la intensidad de la señal de las imágenes del canal TRITC para que cada espermatozoide pueda ser visible y cuantificado.
Para realizar un seguimiento de los espermatozoides en imágenes de lapso de tiempo, utilice el software Fiji para el análisis. Utilice la función De importación de biote format para importar las imágenes de una serie de lapso de tiempo como una hiperarmeta. A continuación, haga clic en Plugins, Tracking y, a continuación, en Manual Tracking.
En el cuadro de diálogo abierto, seleccione la herramienta TrackMate en la barra de herramientas de Fiji. Haga doble clic en el esperma que se realizará un seguimiento. Haga clic dentro del círculo verde que aparece con líneas discontinuas y arrástrelo hasta la posición deseada.
Haga clic en el círculo de nuevo. La línea verde discontinua se convierte en una línea verde sólida. Pulsa simultáneamente las teclas Mayús y L para activar el modo de seguimiento.
Vaya al siguiente fotograma de la serie time-lapse. Para establecer la nueva ubicación del esperma rastreado en el nuevo marco, coloque el ratón sobre el nuevo punto y pulse la tecla A. El rastreador aparece en la nueva ubicación, y aparece una línea, conectando la ubicación donde se ha colocado el rastreador en el fotograma anterior.
Repita el mismo procedimiento para el resto de fotogramas. Una vez completadas las trazas, haga clic en Analizar en el cuadro de diálogo TrackMate para generar los datos necesarios. Para calcular la velocidad, divida la longitud total del trayecto de los espermatozoides por el tiempo transcurrido.
Para calcular la velocidad vectorial, dibuje una línea a través del útero a partir de la vulva, apuntando hacia la espermatozoides. Utilice la herramienta Línea para medir la distancia que los espermatozoides han migrado a lo largo de esta línea desde el principio hasta el final de la traza. Divida esta distancia por el tiempo transcurrido.
Los valores negativos indican que los espermatozoides han migrado lejos de la espermatozoides. Para registrar la frecuencia de inversión, cuente el número de veces durante el cual el trazado de espermatozoides ha generado un ángulo inferior a 90 grados durante tres marcos de lapso de tiempo consecutivos. En este protocolo, los gusanos machos fog-2 q71 fueron manchados con mito-teñido y acoplados a hermafroditas N2 de tipo salvaje.
El tracto reproductivo hermafrodita adulto tiene dos brazos que son imágenes espejo entre sí. Tras el apareamiento, los espermatozoides etiquetados se depositan en el útero hermafrodita a través de la vulva. Los espermatozoides se mueven alrededor de los embriones en desarrollo dentro del útero, hacia la espermatozoides, donde se almacenan hasta la fertilización.
El útero hermafrodita se dividió en tres zonas para cuantificar la distribución y migración de espermatozoides. Para evaluar la velocidad y la frecuencia de inversión de los espermatozoides, solo se mediante el seguimiento de espermatozoides en la zona dos se les mediante imágenes de lapso de tiempo. Los espermatozoides de la zona uno, a partir de la vulva, y la zona tres, incluida la espermatozoide, tienden a moverse en un patrón circular.
Los espermatozoides marcados por los puntos rojos y azules tenían la velocidad del esperma y la frecuencia de reversión cuantificadas. Al cuantificar la distribución de espermatozoides en el útero, la guía adecuada de espermatozoides usando hermafroditas N2 de tipo salvaje y machos de niebla-2 q71 dio como resultado aproximadamente el 90% de los espermatozoides etiquetados que alcanzaban la espermatozoides. Los datos no deben ser contados si el apareamiento resulta en muy pocos espermatozoides en el útero o demasiados espermatozoides en el útero, llenando cada grieta.
Es importante que los animales se manipulen suavemente durante cada paso de transferencia, que los hermafroditas se inmovilicen completamente, y que las placas y gusanos que contienen el mio-teñido estén protegidos de la luz. Este método puede combinarse con experimentos de derribo o eliminación de genes, experimentos de exposición ambiental o química u otras manipulaciones para identificar factores que pueden regular la migración de espermatozoides. Esta técnica nos ha permitido identificar prostaglandinas específicas que son importantes para guiar el esperma hacia el ovocitos.
Estas prostaglandinas se sintetizan a través de un mecanismo no convencional que puede ser conservado en mamíferos superiores. Tetramisole, tricaína, DMSO son irritantes de la piel y los ojos y pueden tener efectos tóxicos a dosis altas. Es importante usar el equipo de protección adecuado al manipular cualquier producto químico.
