이노시톨 인산염 및 인산조류는 진핵생물에 여러 가지 조절 기능이 있는 대사산물로, 유전자 발현, 단백질 인신매매, 신호 트랜스듀션 및 세포 발달의 조절을 포함한다. 그(것)들은 단백질에 결합하여, 그로 단백질 형성, 촉매 활동, 또는 단백질 상호 작용을 변화시킴으로써 이 규정 기능을 능력을 발휘합니다. 이노 시 톨 인산염 또는 인포이 노 시 티드에 바인딩 하는 단백질의 식별 은 그 대사 산물 그들의 규제 기능을 수행 하는 방법을 이해 하는 데 필수적이다.
이 프로토콜은 민감하고 방사능이 없고 리포솜이 없는 간단한 워크플로우를 가지고 있으며 시판되는 시약을 사용합니다. 이 방법에서, 생물요시톨 인산염 또는 인광조류를 가진 완성된 크로마토그래피는 상호 작용하는 단백질을 분리하는 데 사용되며, 그 후 서양 얼룩또는 질량 분석법에 의해 식별된다. 혈류 형태의 경우, HMI-9 미디어에서 T.brucei 세포를 중간 로그 단계로 성장시키고, 10%의 FBS를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 보충합니다.
밀리리터당 800, 000 및 160만 개의 세포 사이의 세포 밀도를 유지합니다. 준비가 되면 세포를 1600배 G로 원심분리하고 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고, 부드럽게 세포를 세척하기 위해 섭씨 37도에서 사전 가열 PBS-G의 10 밀리레에서 펠릿을 다시 중단.
세포를 1600배 G로, 실온에서 5분간 심혈을 완료합니다. 이 세탁 절차를 두 번 더 반복하십시오. 그런 다음 PBS-G의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
이 서스펜션을 1점 5밀리리터 튜브로 옮긴 다음 원심분리기를 1600회 G로 5분간 전송합니다. 상체를 버리고, 용해 버퍼의 제로 포인트 5 밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고, 1점 5 X 프로테아제 억제제 칵테일과 세포를 용액하기 위해 얼음에 미리 냉각된 X 포스파타제 억제제 칵테일 1개를 보충한다. 1400회 G와 섭씨 4도에서 10분간 리자테를 원심분리합니다.
이 후에 추출한 기생충 단백질을 포함하는 상체를 결합된 assays를 위한 새로운 1점 5 밀리리터 튜브로 수집합니다. 서부 얼룩 분석을 위해 총 lysate의 5 %를 따로 둡니다. 아가로즈 비드에 공인이노시톨 인산염 또는 인광증제 50마이크로리터를 수집하고 500밀리리터의 결합 버퍼를 추가합니다.
원심분리기는 1분 동안 1000배 G로 원심분리기. 상체를 버리고 50 마이크로리터의 바인딩 버퍼로 다시 일시 중지하여 구슬을 평형화합니다. 비공액 구슬을 컨트롤로 사용하고 비인산 형태를 포함한 다른 인산염 구성을 가진 구슬을 사용하여 특이하지 않은 상호 작용을 제어합니다.
다음으로, 세포 용액 또는 정제 된 단백질에 IP 또는 PI 구슬 50 마이크로 리터를 추가합니다. 구슬의 볼륨을 전체 lysate의 10% 이내로 유지합니다. 필요한 경우 바인딩 버퍼를 사용하여 바인딩 반응의 볼륨을 조정합니다.
50rpm에서 회전하는 동안 1 시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 반응을 배양하십시오. 그 후, 원심 분리는 1000 시간 G에서, 그리고 1 분 동안 섭씨 4도에서 믹스를 분리합니다. 상체를 제거하고 펠릿을 유지하여 서부 얼룩 분석을 위해 상체의 5 %를 유지하십시오.
그런 다음 세척 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 튜브를 탭하거나 소용돌이어 수지를 다시 중단합니다. 원심 분리는 1000 배 G에서 반응을, 그리고 1 분 동안 섭씨 4도에서, 상체를 폐기. 총 5개의 세시에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
그 후, 구슬에 710 밀리몰러 2-mercaptoethanol으로 보충 된 2X Laemmli 버퍼의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 혼합을 누르거나 소용돌이를 혼합하고 단백질을 희석시다. 다음으로, 5분간 섭씨 95도에서 가열하고 원심분리기는 10, 000회 G에서 1분간 가열합니다.
상체를 수집하고, 영하 80도에서 용액을 동결하거나, 서부 얼룩 분석을 진행한다. 여기에 제시된 방법은 T.brucei lysate로부터 억압자 활성제 단백질 1또는 재조합 T.brucei 억압자-활성제 단백질 1 단백질에 의해 오피의 결합을 분석하는 데 사용된다. RAP1에는 정식 PI 결합 도메인이 없기 때문에, 결합 분석법은 비인성, 또는 이노시톨 링의 다른 위치에서 인포로 인포화되는 피전에, 그리고 비공액아가로즈 비드와 함께 수행됩니다.
서양 분석에 따르면 RAP1은 PI(3, 4, 5)P3 구슬에 우선적으로 바인딩되지만 PI(4, 5)P2 구슬에 덜 바인딩됩니다. 그러나 다른 피처 나 아가로즈 구슬에 결합하지 않았습니다. RAP1이 피전에 직접 결합하는지 여부를 테스트하기 위해, C 말단 태그 6XHis 재조합 RAP1 단백질은 E.Coli에서 균질성으로 표현되고 정제됩니다.
서양 블로팅은 PI(3, 4, 5)P3의 농도를 증가시키지만 PI(4, 5)P2는 PI(3, 4, 5)P3 구슬을 가진 재조합 RAP1의 상호 작용을 억제하는 것을 보여준다. T.브루시 정제 PIP5Pase 효소를 첨가하여 재조합 RAP1에 의한 PI(3, 4, 5)P3 결합을 복원하였다. 이것은 무료 PI (3, 4, 5)P3의 PIP5Pase dephosphorylation 때문이며, 따라서 이 대사 산물의 인광 패턴이 우리의 RAP1 바인딩에 필수적임을 나타냅니다.
Ins (1, 4, 5)P3에 결합하는 T.brucei 단백질은 질량 분석다음에 친화성 크로마토그래피에 의해 확인됩니다. SDS-PAGE 분석은 Ins (1, 4, 5)P3 구슬에서 출루된 단백질의 농축을 대조군 아가로즈 구슬에서 용출한 단백질과 비교하여 보여줍니다. 250개 이상의 단백질을 확인한 용출단백질의 질량 분석 분석은 84개의 단백질이 대조구에 비해 Ins(1, 4, 5)P3 구슬로 농축되었다.
Ins(1, 4, 5)P3에 결합된 단백질의 농축은 대조구에 비해 SDS-PAGE에서 검출된 단백질 신호와 상관관계가 있습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 적절한 컨트롤을 사용하여 비특정 상호 작용에서 특정한 것을 구별하는 것입니다. 비인산염 형태를 포함한 다양한 인산염 구성을 사용하여 비공액 아가로즈 구슬과 이노시톨 인산염 또는 인광성으로 결합된 구슬을 사용하는 것이 좋습니다.
이 방법은 Trypanosoma cruzi, leishmania, 또는 plasmodium과 같은 그밖 단세포 원생동물 기생충에 적용될 수 있습니다. 또한 효모 또는 포유류 세포를 포함한 다른 유기체에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 방법은 SILAC와 같은 정량질량 분석법에 결합하여 이노시톨 인산염 또는 인광조류를 가진 단백질의 동적 상호 작용을 식별할 수 있다.
또한 세포 외 분획과 결합될 수 있으며, 이러한 대사 산물에 결합하는 세포세포 특이적 단백질을 식별할 수 있습니다. 이 접근법은 T.brucei, 포유류 세포 및 효모에 있는 이노시톨 인산염 및 인포이노시티드에 결합하는 단백질을 확인하는 것을 도왔습니다. 그것은 인포이노시티드에 결합하는 새로운 단백질 도메인을 확인하는 데 도움이되었습니다.
그것은 이 대사 산물의 조절 기능, 유전자 발현에 있는 그들의 역할, 세포 발달 및 진핵생물에 있는 신호 전염을 이해하는 쪽을 포장했습니다. 이 프로토콜의 일부 시약은 독성 또는 인화성입니다. 개인 보호 장비를 사용하고 필요한 경우 연기 후드에서 작업하십시오.
