אינוזיטול פוספט ופוספוינוזיטידים הם מטבוליטים שיש להם מספר פונקציות רגולטוריות באוקריוטים, כולל שליטה בביטוי גנים, סחר בחלבון, התמרת אותות ופיתוח תאים. הם מבצעים את התפקוד הרגולטורי הזה על ידי קשירה לחלבונים, ובכך משנים את קונפורמציית החלבון, הפעילות הקטאליטית או אינטראקציות החלבון. זיהוי חלבונים שנקשרים אינוזיטול פוספט או phosphoinositides חיוני כדי להבין כיצד מטבוליטים אלה לבצע את תפקידם הרגולטורי.
פרוטוקול זה כולל זרימת עבודה פשוטה, שאינה רדיואקטיבית, נטולת ליפוזום ומשתמשת בריאגנטים הזמינים מסחרית. בשיטה זו, כרומטוגרפיה מוגמרת עם אינוזיטול פוספט ביוטינול או phosphoinositides, משמש כדי לבודד חלבונים אינטראקציה, הם מזוהים לאחר מכן על ידי כתם מערבי, או ספקטרומטריית מסה. לצורות זרם דם, לגדל תאי T.brucei לשלב יומן אמצע במדיה HMI-9, בתוספת 10% FBS, ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני.
שמור על צפיפות התאים בין 800, 000 ל-1.6 מיליון תאים למיליליטר. כאשר מוכן, צנטריפוגה התאים ב 1600 פעמים G, ו בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו בעדינות את גלולת הכדור ב-10 מיליליטר של PBS-G מחוממים מראש ב-37 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את התאים.
צנטריפוגה התאים ב 1600 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי להשלים את הכביסה. חזור על הליך כביסה זה פעמיים נוספות. ואז תן שימוש חוזר את גלולה במיליליטר אחד של PBS-G.
העבר השעיה זו לנקודה אחת חמש צינור מיליליטר, אז צנטריפוגה ב 1600 פעמים G במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את גלולת האפס בנקודה אפסית חמישה מיליליטר של חיץ תיזה, בתוספת נקודה אחת חמש קוקטייל מעכבי פרוטאז X, וקוקטייל מעכב פוספטאז X אחד שהוקרן מראש על הקרח כדי לתפור את התאים. צנטריפוגה ליאזט ב 1400 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
לאחר מכן לאסוף את supernatant, אשר מכיל את חלבוני הטפיל שחולצו, לתוך נקודה אחת חדשה חמש מיליליטר צינור עבור משגיחי מחייב. הניחו בצד 5% מסך ה-lysate לניתוח כתם מערבי. לאסוף 50 microliters של אינוזיטול פוספטים או phosphoinositides גדמו חרוזים אגרוז, ולהוסיף להם 500 מיליליטר של חיץ מחייב.
צנטריפוגה ב 1000 פעמים G לדקה אחת. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש ב-50 מיקרוליטרים של חיץ מחייב כדי לצייד את חרוזים. השתמש חרוזים שאינם נדנוד כפקד, ולהשתמש חרוזים עם תצורות פוספט שונות כולל צורות שאינן פוספוריאט, כדי לשלוט עבור אינטראקציות ספציפיות.
לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של חרוזי IP או PI לתא ליאזט או לחלבונים המטוהרים. שמור את נפח חרוזים בטווח של 10% מסך ה- lysate. במידת הצורך, השתמש במאגר איגוד כדי לכוונן את עוצמת הקול של תגובת האיגוד.
הדגירה את התגובה במשך שעה אחת או לילה בארבע מעלות צלזיוס, תוך סיבוב בשעה 50 סל"ד. לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת ב 1000 פעמים G, וב ארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת. הסר את supernatant, ולשמור את גלולה, הקפד לשמור על 5% של supernatant לניתוח כתם מערבי.
לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ כביסה והקש או ערבב את הצינור כדי להשתמש שוב בסרף. צנטריפוגה התגובה ב 1000 פעמים G, וב ארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת, ולהשליך את העל טבעי. חזור על תהליך זה עבור סך של חמש שטיפות.
לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של חיץ 2X Laemmli בתוספת 710 מילימולר 2-mercaptoethanol כדי חרוזים. הקש או מערבולת כדי לערבב, ולדלל את החלבונים. לאחר מכן, מחממים ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, וצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך דקה אחת.
לאסוף את supernatant, או להקפיא את eluate במינוס 80 מעלות צלזיוס, או להמשיך לניתוח כתם המערבי. השיטה המוצגת כאן משמשת לניתוח הכריכה של PIs על ידי חלבון מפעיל מדכא 1 מ T.brucei lysate, או על ידי חלבון רקומביננטי T.brucei מדכא-activator 1 חלבון. כמו RAP1 חסר תחומים מחייב PI קנוני, בדיקות מחייב מבוצעות עם PIs שאינם זרחן, או כי הם זרחן בעמדות שונות של טבעת אינוזיטול, ועם חרוזים עלה שאינם גדומים.
ניתוח מערבי מראה כי RAP1 נקשר באופן מועדף על חרוזי PI(3, 4, 5)P3, אך הוא גם נקשר במידה פחותה ל- PI(4, 5)P2 חרוזים. עם זאת, הוא לא נקשר לכל PIs אחרים או גם חרוזים. כדי לבדוק אם RAP1 נקשר ישירות PIs, C מתויג סופני 6XHis חלבון RAP1 רקומביננטי מבוטא ומטוהר הומוגניות מ E.Coli.
כתמים מערביים מראים כי הגדלת הריכוז של PI(3, 4, 5)P3, אך לא PI(4, 5)P2, מעכבת את האינטראקציה של RAP1 רקומביננטי עם חרוזים PI(3, 4, 5)P3. התוספת של אנזים PIP5Pase מטוהר T.brucei לתגובה משוחזר PI(3, 4, 5)P3 מחייב על ידי RAP1 רקומביננטי. זאת בשל PIP5Pase dephosphorylation של PI חינם(3, 4, 5)P3, ולכן מציין כי דפוס זרחון של מטבוליט זה חיוני עבור RAP1 שלנו מחייב.
חלבוני T.brucei שנקשרים ל- Ins(1, 4, 5)P3 מזוהים לאחר מכן על ידי כרומטוגרפיה של זיקה ואחריה ספקטרומטריית מסה. ניתוח SDS-PAGE מראה העשרה בחלבונים שחמקו חטוזי Ins(1, 4, 5)P3, בהשוואה לחלבונים שחמקו מקרני הבקרה. ניתוח ספקטרומטריית מסה של החלבונים האלוטים זיהה מעל 250 חלבונים מהם 84 הועשרו ב- Ins(1, 4, 5)P3, בהשוואה לחרוזי בקרה.
העשרת חלבונים הקשורים Ins(1, 4, 5)P3, לעומת חמוזי בקרה, בקורלציה עם אות החלבון שזוהה על ידי SDS-PAGE. שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא השימוש בפקדים מתאימים, כדי להפלות ספציפי מאינטראקציות לא ספציפיות. אנו ממליצים להשתמש גם פדרוזים שאינם גדומים, וחרוזים עם אינוזיטול פוספט או פוספוינוזיטידים, תוך שימוש בתצורות פוספט שונות, כולל צורות שאינן פוספוסוריאטים.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על טפילי פרוטוזואן חד-תאיים אחרים, כגון טריפאנוסומה קרוזי, לישמניה או פלסמודיום. זה יכול גם להיות מותאם בקלות אורגניזמים אחרים, כולל שמרים או תאים יונקים. שיטה זו יכולה להיות מצמד ספקטרומטריית מסה כמותית, כגון SILAC, כדי לזהות אינטראקציות דינמיות של חלבונים עם אינוזיטול פוספט או phosphoinostides.
ב יכול גם להיות משולב עם שבר תת תאי, כדי לזהות חלבונים ספציפיים organelle להיקשר מטבוליטים אלה. גישה זו סייעה לזהות חלבונים שנקשרים אינוזיטול פוספט ופוספוינוזיטידים ב T.brucei, תאים יונקים, ושמרים. היא סייעה בזיהוי תחומי חלבון חדשים שנקשרים לפוספוינוזיטידים.
היא סללה את הדרך להבנת הפונקציה הרגולטורית של מטבוליטים אלה, תפקידם בביטוי גנים, התפתחות תאים והתמרת אותות באוקריוטים. חלק מהריגנסים בפרוטוקול זה רעילים, או דליקים. השתמש בציוד מגן אישי, ובמידת הצורך, לעבוד ברדס אדים.
