İnositol fosfat ve fosfoinositititler ökaryotlarda gen ekspresyonu, protein ticareti, sinyal transdüksiyonu ve hücre gelişimi gibi çeşitli düzenleyici işlevlere sahip metabolitlerdir. Proteinlere bağlanarak bu düzenleyici işlevi yerine getirirler, bu nedenle protein konformasyonunu, katalitik aktiviteyi veya protein etkileşimlerini değiştirirler. İnositol fosfat veya fosfoinosititlere bağlanan proteinlerin tanımlanması, bu metabolitlerin düzenleyici işlevlerini nasıl yerine getirtiklerini anlamak için gereklidir.
Bu protokol, hassas, radyoaktif olmayan, liposome ücretsiz basit bir iş akışı vardır ve ticari olarak kullanılabilir reaktifler kullanır. Bu yöntemde, biyotinylated inositol fosfat veya fosfoinositititler ile bitmiş bir kromatografi, etkileşimproteinleri izole etmek için kullanılır, daha sonra batı leke ile tanımlanır, veya kütle spektrometresi. Kan akımı formları için, HMI-9 medya orta günlük fazT T.brucei hücreleri büyümek, ile takviye 10%FBS, 37 derece Santigrat, ile 5%Karbondioksit.
Hücre yoğunluğunu mililitre başına 800, 000 ve 1,6 milyon hücre arasında tutun. Hazır olduğunuzda, hücreleri 1600 kez G'de ve oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve yavaşça pbs-G önceden ısıtılan 10 mililetre hücreleri yıkamak için 37 santigrat derece de ısıtılan pelet yeniden askıya.
Yıkamayı tamamlamak için hücreleri 1600 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin. Bu yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Sonra pbs-G bir mililitre pelet resuspend.
Bu süspansiyonu bir nokta beş mililitrelik tüpe aktarın, sonra 1600 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın, ve lysis tampon sıfır noktası beş mililitre pelet resuspend, bir nokta beş X proteaz inhibitör kokteyl ile takviye, ve hücreleri lyse buz üzerinde önceden soğutulmuş olan bir X fosfataz inhibitörü kokteyl. 1400 kez G ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede lysate santrifüj.
Bu supernatant toplamak sonra, hangi çıkarılan parazit proteinleri içerir, bağlayıcı tahliller için yeni bir nokta beş mililitre tüp içine. Batı leke analizi için toplam lysate% 5 ayırın. Agarose boncuklar için konjuge inositol fosfatveya fosfoinositititler 50 mikrolitre toplamak ve bağlayıcı tampon 500 mililitre ekleyin.
Bir dakika lığına 1000 kat G'de santrifüj. Supernatant atın ve boncukları dengelemek için bağlama tampon 50 mikrolitre resuspend. Konjuge olmayan boncukları kontrol etmek için kullanın ve spesifik olmayan etkileşimleri kontrol etmek için fosforilasyonsuz formlar da dahil olmak üzere farklı fosfat konfigürasyonlarına sahip boncuklar kullanın.
Daha sonra, hücre lysate veya saflaştırılmış proteinler e 50 mikrolitre IP veya PI boncuk ekleyin. Boncuk hacmini toplam lysate%10 içinde tutun. Gerekirse, bağlama reaksiyonunun hacmini ayarlamak için bağlama arabelleği kullanın.
50rpm dönerken, dört santigrat derece ya bir saat veya bir gecede için reaksiyon kuluçka. Bundan sonra, karışımı 1000 kez G'de santrifüj edin ve bir dakika boyunca dört derece santigrat derecede. Supernatant çıkarın ve pelet tutmak, batı leke analizi için supernatant% 5 tutmak için emin olun.
Sonra yıkama tampon bir mililitre ekleyin ve dokunun veya reçin yeniden askıya almak için tüp girdap. Reaksiyonu 1000 kez G'de ve dört santigrat derecede bir dakika için santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Toplam beş yıkama için bu işlemi tekrarlayın.
Bundan sonra, boncuklar için 710 milimolar 2-mercaptoetanol ile takviye 2X Laemmli tampon 50 mikrolitre ekleyin. Karıştırmak için dokunun veya girdap, ve proteinleri seyreltmek. Sonra, 95 derecede beş dakika ısı, ve bir dakika için 10,000 kez G santrifüj.
Supernatant toplamak ve ya eksi 80 santigrat derece eluate dondurmak, ya da batı leke analizi devam edin. Burada sunulan yöntem, PI'lerin T.brucei lysate'den represör-aktivatör protein 1 veya rekombinant T.brucei repressor-aktivatör protein 1 proteini ile bağlanmasını analiz etmek için kullanılır. RAP1 kanonik PI bağlayıcı etki alanlarından yoksun olduğundan, bağlayıcı tahliller fosforile olmayan veya inositol halkasının farklı konumlarında fosforilasyon adedi olan pi'ler ve konjuge olmayan agarose boncuklarla gerçekleştirilir.
Batı analizi RAP1'in tercihen PI(3, 4, 5)P3 boncuklara bağladığını, ancak aynı zamanda PI(4, 5)P2 boncuklarına daha az bağladığını göstermektedir. Ancak, başka bir veya agarose boncuk bağlamak vermedi. RAP1'in doğrudan PI'lere bağlanıp bağlanmadığını test etmek için, C ölümcül etiketli 6XHis rekombinant RAP1 proteini E.Coli'den homojenliğe doğru ifade edilir ve saflaştırılır.
Batı lekeleme pi konsantrasyonu artan gösterir (3, 4, 5)P3, ama PI(4, 5)P2, PI (3, 4, 5)P3 boncuk ile rekombinant RAP1 etkileşimini inhibe. Reaksiyona T.brucei saflaştırılmış PIP5Pase enziminin eklenmesi pi(3, 4, 5)P3 bağlanmasını rekombinant RAP1 ile geri yükledi. Bunun nedeni serbest PI(3, 4, 5)P3'ün PIP5Pase defosforilasyondur ve bu nedenle bu metabolitin fosforilasyon paterninin RAP1 bağlamamız için gerekli olduğunu gösterir.
İns'e bağlanan T.brucei proteinleri (1, 4, 5)P3 daha sonra kütle spektrometresi ile afinite kromatografisi ile tanımlanır. SDS-PAGE analizi, Ins(1, 4, 5)P3 boncuklarından elde edilen proteinlerdeki zenginleşmeyi, kontrol agarose boncuklarından elde edilen proteinlere kıyasla göstermektedir. Eluted proteinlerin kütle spektrometresi analizi 250'den fazla protein tespit edilmiştir ve bunların 84'ü Ins(1, 4, 5)P3 boncuklarla zenginleştirilmiştir.
İns(1, 4, 5)P3'e bağlı proteinlerin zenginleşmesi, kontrol boncuklarıyla karşılaştırıldığında, SDS-PAGE tarafından saptanan protein sinyali ile ilişkilidir. Bu protokoldeki kritik bir adım, belirli olmayan etkileşimlerden belirli bir ayrım yapmak için uygun denetimlerin kullanılmasıdır. Konjuge olmayan agarose boncuklar ve inositol fosfat veya fosfoinosititlerle konjuge boncuklar kullanarak fosforilasyonsuz formlar da dahil olmak üzere çeşitli fosfat konfigürasyonları kullanmanızı öneririz.
Bu yöntem, Trypanosoma cruzi, leishmania veya plazmodyum gibi diğer tek hücreli protozoon parazitlerine uygulanabilir. Ayrıca kolayca maya veya memeli hücreleri de dahil olmak üzere diğer organizmalar, adapte edilebilir. Bu yöntem, inositol fosfat veya fosfoinosid ile proteinlerin dinamik etkileşimlerini belirlemek için SILAC gibi kantitatif kütle spektrometresi ile birleşebilir.
Ayrıca subsellüler fraksiyonu ile kombine edilebilir, Bu metabolitlere bağlamak organel özgü proteinleri tanımlamak için. Bu yaklaşım, T.brucei, memeli hücreleri ve mayainin inositol fosfat ve fosfoinositititlerine bağlanan proteinlerin belirlenmesine yardımcı olmuştur. Fosfoinosititides'e bağlanan yeni protein alan adlarının belirlenmesine yardımcı oldu.
Bu metabolitlerin düzenleyici işlevini, gen ekspresyonundaki rollerini, hücre gelişimini ve ökaryotlarda sinyal iletimini anlamanın yolunu açmıştır. Bu protokoldeki bazı reaktifler zehirli veya yanıcıdır. Kişisel koruyucu ekipman kullanın ve gerektiğinde, bir duman başlık içinde çalışmak.
