This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. célula de recubrimiento y transfección <ol><li> En una campana de cultivo celular, placa ~ 300,000 a ~ 500.000 SN56 células (una especie de regalo del Dr. Jane Rylett) en una placa de 35 mm confocal con fondo de cristal y cubrir con los medios de comunicación antes de la transfección (medio Eagle modificado por Dulbecco, DMEM, suplementado con 10% FBS). </li><li> Se incuban las células durante la noche a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora a proliferar. Nota: Las células deben ser aproximadamente 50% -70% confluentes antes de la transfección. </li><li> En una campana de cultivo de células, las células transfectar con plásmidos que expresan una proteína fluorescente etiquetados TGN marcador (galactosiltransferasa acoplado a Cyan Proteína Fluorescente, GalT-PPC), una proteína fluorescente etiquetada marcador compartimento (en este caso, lisosoma asociada proteína de membrana 1, LAMP1, etiquetadas con mRFP), y la proteína de interés etiquetado con paGFP (βAPP-paGFP). (Estos constructos se han descrito previamente 30) </li><li> Se incuban las células con reactivo de transfección de ADN y el plásmido fo 24 horas a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Utilice una proporción de ~ 2 g de ADN a 5 l de agente de transfección (por ejemplo, Lipofectamine 2000) para la citotoxicidad mejor equilibrio y la eficiencia de transfección. Las concentraciones reales pueden necesitar ser optimizada para diferentes plásmidos. En los experimentos descritos aquí, utilizar 1 g / plato confocal de βAPP-paGFP, 0,3 mg / placa confocal de LAMP1-mRFP, y 0,2 g / plato confocal de GalT-PPC. Nota: La cantidad de plásmido utilizado dependerá de la eficacia de transfección. </li><li> Para las líneas de células neuronales: Después de la etapa 1.4, en una campana de cultivo de células, retirar el medio de transfección pre-y diferenciar células SN56 en 2 ml de DMEM suplementado con 0,1% de penicilina / estreptomicina con 1 mM dibutiril AMP cíclico (dbcAMP) durante 24 horas. </li></ol> 2. Microscopio Preparación Etapa <ol><li> Pre-caliente-buffer fosfato salino (PBS) y solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 37 ° C. Platina del microscopio de calentamiento antes de imaging a 37 ° C. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS, para eliminar los medios de diferenciación y reemplazan con 2 ml de HBSS a 37 ° C. Coloque las células en fase de microscopio calentado a 37 ° C. Nota: Las células son viables por aproximadamente 1,5-2 horas en HBSS. </li><li> Permitir 5-10 minutos para la temperatura de la placa confocal se equilibre con la platina del microscopio. </li></ol> 3. Foto-activación de regiones de interés sobre el aparato de Golgi <ol><li> Con el ocular del microscopio, encontrar células transfectadas con GalT-PPC, LAMP1-mRFP y βAPP-paGFP. <ol><li> Utilice una lente de inmersión en aceite con una gran ampliación (es decir, 63X o 100X). Para la conformación visual de fluorescencia, utilice un conjunto de filtros capaces de visualizar FITC (por PPC y la fluorescencia de GFP) y rodamina (por mRFP fluorescencia). </li></ol></li><li> Establezca la rebanada confocal para cada canal a 1 micras. Tome una imagen de baja resolución. </li><li> Recortar para imagen sólo la célula de interés. </li><li> Usando el botón de ajuste, ajuste manualel plano focal a la mitad de la célula. Esta es típicamente la parte de la célula donde el núcleo es la más grande. </li><li> Dibujar 3-5 Regiones circulares de Interés (ROI) dentro del TGN (GalT-PPC fluorescencia). <ol><li> Para dibujar regiones de interés (es decir, en el programa Zeiss LSM), seleccione el botón &#39;Editar ROI&#39; en la consola de comandos. </li><li> Seleccione el botón ROI circular. </li><li> Haga clic y arrastre sobre la GalT-PPC regiones positivos de la célula. Nota: Los paquetes de foto-blanqueadores para muchos microscopios tienen esta capacidad. </li></ol></li><li> Tome una imagen de la célula con el superpuesto ROIs. Guardar una copia de las regiones de interés para su posterior consulta. <ol><li> Para guardar el rendimiento de la inversión a la imagen, seleccione el botón &#39;Macro&#39;. </li><li> Pulse el botón &#39;Load&#39; para iniciar el &#39;CopyRoisToOverlay&#39; (ruta de archivo: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb). Nota: Un microscopio confocal equipado con 475 a 525 nm (PPC) banda de paso (BP), un 500-530 nm BP (GFP),y se requieren unos 560 nm pase largo (LP) los conjuntos de filtros. También se requiere un láser de argón para 458 nm y 488 nm de emisión y un láser de HeNe para la emisión de 540 nm. </li></ol></li><li> Puesta en marcha del microscopio para un curso de tiempo de lejía. <ol><li> Ajuste el diodo láser (25 mW 405 nm láser) a la máxima potencia. Precaución: El exceso de foto-activación podría llevar a la foto-toxicidad o daño a las membranas celulares. Utilice protección para los ojos para evitar daños en la retina. </li><li> Puesta en marcha del microscopio para 120 ciclos de formación de imágenes. Nota: Un ciclo de imagen consiste en el blanqueo en el rendimiento de la inversión y la imagen de toda la célula. Este es un curso de tiempo lejía. </li><li> Ajuste el microscopio para blanquear (foto-activación) sólo el ROI por 20-30 iteraciones después de cada imagen. El tiempo para la imagen y la lejía una imagen variará. Establecer un retardo de tiempo entre las imágenes de manera que cada ciclo es de aproximadamente 30 seg. Nota: La parte de la imagen de cada ciclo dura aproximadamente 15 a 30 segundos dependiendo del tamaño de la imagen. El blanqueo para cada ROI es de unos 50 ms. El blanqueo de los 4 regiones de interés para 20 iteraciones se llevará a 4 segundos al final de cada ciclo de lejía / imagen. </li></ol></li><li> Empieza el curso temporal de lejía. </li><li> Apagar el blanqueo después de 15 min (30 ciclos de formación de imágenes y blanqueo), pero seguir capturando imágenes de la célula. Nota: El tiempo de 0 a 15 minutos es el periodo de &#39;pulso&#39;. </li><li> Continuar capturar imágenes durante 45 minutos (sin blanquear), seguir la liquidación de βAPP-paGFP. Nota: El tiempo de 15 a 45 minutos es el periodo de &#39;persecución&#39;. </li><li> Utilizando el método de análisis descrito en el paso 6, co-localizar la proteína de interés (en este caso, βAPP-paGFP) con el compartimento de interés (en este caso, LAMP1-mRFP) haciendo superficies a cada canal. </li></ol> 4. Determinar el compartimiento de Downstream <ol><li> Para determinar si los lisosomas (en estos experimentos) son el compartimiento final, añadir inhibidores de la proteasa-membrana permeable para causar proteínas se acumulen en el lisosoma.<ol><li> Para βAPP, utilice 0,5 M L685, 458 (inhibidor de la γ-secretasa específica) durante la noche o la cloroquina 100 micras (deacidifies lisosomas) durante 30 min antes de formación de imágenes. </li></ol></li><li> Encuentra células y fotoactivar como en el paso 3,1-3,8. </li><li> Image la célula por un adicional de 45-min (sin foto-activación) para determinar dónde βAPP-paGFP se acumula en ausencia de la escisión. </li><li> Analizar la entrega de la proteína a los lisosomas (u otro compartimiento de corriente abajo) y el aclaramiento posterior de acuerdo con el método descrito en el paso 6. </li></ol> 5. Asegurar la precisión de Photo-activación en el aparato de Golgi <ol><li> Calentamiento HBSS a 37 ° C. </li><li> Preparar una solución de 2 ml, por cada placa confocal para obtener imágenes, de 66 M nocodazole (tratamiento) o DMSO (control) en HBSS. <ol><li> Para una placa confocal, pipeta 2 ml de HBSS 37 ° C y añadir 7,96 l de nocodazol de una población de nocodazol 16.60 mM. </li><li> Como control tanlución, pipeta 2 ml de HBSS 37 ° C en un tubo de 2 ml y añadir 7,96 l de DMSO. </li></ol></li><li> Se incuban las células en HBSS con nocodazol o DMSO durante 5 min antes de formación de imágenes. </li><li> Encuentra las células como en el paso 3.1. </li><li> Antes de fotoactivación, preparar el microscopio para tomar un Z-pila después del período de la foto-activación. <ol><li> Haga clic en el botón &#39;Z Stack&#39;. Comenzar a escanear utilizando XY rápida. </li><li> Ajuste el plano focal con la perilla de ajuste microscopio para la parte superior de la celda. Pulse &#39;Marcos Primera&#39; para establecer la primera posición en la pila. </li><li> Ajuste el plano focal con la perilla de ajuste microscopio para la parte inferior (la más cercana al vidrio) de la célula. Pulse &#39;Marcos Última&#39; para establecer la última posición en la pila. </li><li> En el panel de pila Z, pulse el botón &#39;Z seccionar&#39;. Ajuste el &#39;Intervalo&#39; a 1 micras. Nota: Para obtener una resolución espacial más alta pila de un intervalo de pila más pequeña, pero más imágenes tendrán quetomarse alargar el período de formación de imágenes para la pila. </li></ol></li><li> Bleach las células, tal como se describe en el paso 3/7 a 3/8. Foto desactivar e imagen desde 0 min y 15 min (30 cuadros). </li><li> Deje de imagen después de 30 marcos. Inmediatamente guardar una imagen del vídeo. Precaución: Algunos microscopios pueden sobrescribir primer video si no se guarda antes de iniciar una segunda secuencia de imágenes. </li><li> Después de guardar el video, adquirir de inmediato una Z-pila, utilizando los parámetros desde el paso 5.5. </li><li> Co-localizar βAPP-paGFP con GalT-PPC (u otro marcador de Golgi), como se describe en el paso 6. Nota: PPC fotoblanqueadores rápidamente y puede que no sea visible por el final del período de formación de imágenes. Colocalización puede que no sea posible con la GalT-PPC. Si se requiere colocalización, mRFP utilizar para etiquetar GalT. </li></ol> 6. Vesícula Filtrado y Colocalización <ol><li> Utilice un programa de análisis (por ejemplo Imaris) para hacer superficies del compartimento (por ejemplo LAMP1-mRFP) y una o proteínaf interés (por ejemplo βAPP-paGFP). </li><li> Introduzca la sección &#39;Supera&#39; del programa de análisis haciendo clic en el botón Surpass en la barra de menú superior. </li><li> Seleccione el botón Asistente de superficie en la parte superior de los más panel izquierdo (5ª botón desde la izquierda). </li><li> Seleccione un canal para filtrar vesículas (es decir, la fluorescencia βAPP-paGFP, proteína de interés). </li><li> Realizar sustracción de fondo mediante la presentación del diámetro de la mayor de la vesícula en el campo para el asistente y pulse siguiente. El programa de análisis selecciona automáticamente - basado en un umbral derivado de la vesícula más grande en el campo - un área en el canal de interés. <ol><li> Para ajustar manualmente el fondo umbral para refinar la selección si es necesario. </li></ol></li><li> En la parte inferior de la pantalla de selección de umbral, compruebe la opción &#39;tocar objetos divididos&#39; para separar las superficies combinado. Nota: Si muchas vesículas están estrechamente agrupados ajuntos, el grupo voluntad programa de análisis de estos objetos en una superficie. <ol><li> Elija 10-15 vesículas representativas y calcular el diámetro medio de vesículas y escriba el resultado en el asistente. </li></ol></li><li> Refinar los puntos de arranque seleccionados aumentando o disminuyendo el umbral en &quot;Calidad&quot; (intensidad del canal en el centro de cada mancha). Nota: Las superficies del canal de interés se creará. El perfeccionamiento de las superficies seleccionadas se puede realizar en este momento. Vesículas umbral basado en el número de píxeles en cada vesícula. </li><li> Máscara del canal original con esta superficie. Para enmascarar, seleccione la cuarta pestaña de la izquierda en el asistente de creación de superficies (lápiz). </li><li> Seleccione &#39;Máscara All&#39;. Se creará un nuevo canal con las vesículas de interés. Nota: Durante el proceso de la máscara, se ofrece la opción de duplicar el canal original. Seleccione esta opción si los datos originales necesita ser salvado. </li><li> Repita steps 6.1 a 6.7 para el canal sin filtrar (es decir LAMP1 mRFP, compartimiento). </li><li> En la barra de herramientas superior, seleccione la herramienta de colocalización. <ol><li> En el panel superior, como aparezcan los histogramas de los canales que se colocalized, seleccionar los canales enmascarados de reciente creación. </li><li> Seleccione todos los datos disponibles. Hay píxeles oscuros que a veces se presente después del análisis. No seleccione estos píxeles en el histograma, van a sesgar los resultados. </li><li> En el panel de la derecha, seleccione &#39;Construir Coloc Channel&#39;. Esto crea un nuevo canal que contiene sólo los píxeles colocalized. Los datos estarán en el mismo panel bajo el botón &#39;Estadísticas Channel&#39;. Los datos se pueden exportar como un archivo CSV. </li><li> Utilice la estadística &#39;Porcentaje de material colocalized&#39;. Esta opción tiene en cuenta la intensidad de los píxeles y el tamaño del objeto. </li></ol></li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia o conflictos de intereses.

Esta técnica se describe la precisión de foto-activación de las proteínas de membrana etiquetados con paGFP en el TGN para visualizar su posterior tráfico y escote. Mientras paGFP fue creado hace una década 25, este es el primer ejemplo de la foto-activación precisa para seguir el tráfico de proteínas nacientes en los diferentes compartimentos aguas abajo. Estudios anteriores utilizando APP-paGFP construye foto activada una región peri-nuclear de la célula, que fue considerado como el Golgi 11...

El sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer (AD) es la presencia de placas seniles y ovillos neurofibrilares (NFTs) en el cerebro. El principal componente de las placas seniles es β-amiloide (Aß). Aß se deriva de su precursor; proteína precursora amiloide (APP) 1. La escisión de APP amiloidogénico comienza con la eliminación del ectodominio de APP por la β-secretasa 2. El fragmento carboxilo terminal 99-residuo restante (CTF) puede ser escindido por γ-secretasa para producir Aß 3-7. Mientras que muchos experimentos han documentado la escisión de APP de la superficie celular después de la internalización de la superficie celular en el sistema endosomal / lisosomal, un número de estudios recientes han sugerido que el tráfico intracelular de APP también es importante en la regulación de su procesamiento 8 a 11. Ha habido un número de intentos en la modulación de los niveles de Aß con inhibidores de la gamma secretasa y-Aß Immunotherapies. Sin embargo, los ensayos clínicos recientes con estas terapias no mostraron ningún beneficio, y, en algunos casos, causó daños 12. Una estrategia sin explotar para modular la producción de Aß es alterar la localización subcelular de la APP y la interacción-γ-secretasa. El aparato de Golgi, membrana plasmática, y los endosomas / lisosomas han sido sugeridos como posibles localizaciones para γ-escisión de APP. La investigación de nuestro laboratorio sugiere que la APP y la γ-secretasa son proteínas residentes de la membrana lisosomal 13. Además, hemos encontrado que la γ-secretasa lisosomales tiene un pH óptimo ácido 13. Además, la alcalinización del sistema endosomal / lisosomal con cloroquina o NH 4 Cl, se ha demostrado que disminuye la producción de Aß 14. gamma-secretasa inhibición o nocaut o presenilina conduce a la acumulación de APP-FASC en el lisosoma 15-17. Por otra parte, la interrupción de APP endocitosis disminuye la producción de Aß de 18-20. A pesar de la importancia del Golgi como una estación de clasificación para las proteínas y las proteínas reciclados desde el sistema endosomal / lisosomal nacientes, el tráfico intracelular de APP no se ha estudiado en detalle 21. Trabajos recientes han demostrado que la APP puede ser reciclado a la red trans-Golgi (TGN) a través de la interacción con el complejo retromer. Regulación a la baja del complejo retromer disminuye la producción de Aß 8,22-24. Sin embargo, la salida de APP desde el Golgi no ha sido bien estudiado. Mientras que después de la endocitosis de las proteínas de la superficie celular, tales como el receptor de transferrina, son fácilmente etiquetados y seguido, tras el tráfico de proteínas intracelulares es más difícil. De hecho, pocas proteínas han tenido su tráfico intracelular fotografiada. El advenimiento de las etiquetas de proteínas fluorescentes, tales como foto-activable-GFP (paGFP), ha proporcionado nuevas herramientas para examinar el tráfico intracelular. Photo-activable-GFP es una forma de GFP que es casi invisible después de la síntesis, pero desarrolla verde fuerte (GFP) de fluorescencia después de ser activado por luz láser 413 nm y esta señal es estable por día 25,26. Las construcciones utilizando paGFP se han utilizado para demostrar el tráfico intralisosomal de la proteína lisosómica proteína de membrana 1 (LAMP1) 25, la entrega de la superficie celular del virus de estomatitis vesicular glicoproteína (VSVG, un marcador de la ruta secretora) 27, y el volumen de los peroxisomas 28 y 29 autofagosomas. Con el fin de visualizar la clasificación de APP desde el TGN en células vivas, hemos diseñado plásmido que expresa los últimos 112 aminoácidos de APP acoplados a la foto-activable (paGFP) en el C-terminal (referido como βAPP-paGFP) 30. También hemos realizado estos experimentos con APP de longitud completa y ha logrado resultados similares; el constructo ΒAPP se utiliza aquí, ya que proporciona imágenes más brillantes. A continuación, la foto-activación y# 946; APP-paGFP sólo en el TGN, como demarcada por el TGN marcador galactosiltransferasa (GalT). Aunque APP ha sido etiquetado con paGFP para visualizar el transporte axonal rápido de la APP y el aclaramiento de la región perinuclear, esta es la primera demostración de tráfico de APP de un compartimento a otro cuidadosamente definido 11,31,32. Aquí, demostramos exacta foto-activación dentro del TGN y la salida de APP en compartimentos de bajada y posterior escisión y el visto bueno de los lisosomas 30. La foto-activación precisa dentro del Golgi es ampliamente aplicable a otros sistemas de proteínas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

Beta-amiloide (Aß) es el constituyente principal de las placas seniles que se encuentran en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Aß se deriva de la escisión secuencial de Proteína Precursora de Amiloide (APP) por β y gamma-secretasas. A pesar de la importancia de Aß a la patología AD, la localización subcelular de estas divisiones no está bien establecida. El trabajo en nuestro laboratorio y otros implican el sistema endosomal / lisosomal en el procesamiento de APP después de la internalización de la superficie celular. Sin embargo, el tráfico intracelular de APP es relativamente poco estudiada. Mientras que las proteínas de la superficie celular son modificables a muchas técnicas de etiquetado, no hay métodos simples para seguir el tráfico de proteínas de la membrana del Golgi. Para ello, hemos creado construcciones APP que fueron etiquetadas fotoactivable GFP (paGFP) en el C-terminal. Después de la síntesis, paGFP tiene baja fluorescencia basal, pero puede ser estimulado con 413 nm luz to producir una fluorescencia de color verde fuerte y estable. Al utilizar el aparato de Golgi marcador galactosiltransferasa acoplado a cian proteína fluorescente (GalT-PPC) como un objetivo, estamos en condiciones de precisión fotoactivar APP en la red trans-Golgi. Activada por fotos APP-paGFP puede entonces ser seguido, ya que trafica a los compartimentos posteriores identificados con fluorescencia etiquetados proteínas marcadoras de compartimentos para el endosoma temprano (Rab5), a finales del endosoma (Rab9) y el lisosoma (LAMP1). Por otra parte, el uso de inhibidores de procesamiento de APP incluyendo cloroquina o el inhibidor de la γ-secretasa L685, 458, estamos en condiciones de realizar experimentos de pulso-caza para examinar el procesamiento de APP en las células individuales. Nos encontramos con que una gran parte de APP se mueve rápidamente hacia el lisosoma sin aparecer en la superficie celular, y luego se elimina del lisosoma por divisiones-secretasa similares. Esta técnica demuestra la utilidad de paGFP para seguir el tráfico y el procesamiento de las proteínas intracelulares from el Golgi a los compartimentos aguas abajo.

Los resultados típicos muestran βAPP dejando el TGN y parece tráfico rápidamente a LAMP1 (Figura 1a y b). Durante el período de fotoactivación, las vesículas se pueden ver saliendo el aparato de Golgi con destino a los lisosomas (Figura 1b). Sin tratamiento inhibidor, paGFP fluorescencia será visible en los lisosomas mientras que hay foto-activación en el TGN. Después de parar la fotoactivación, la βAPP-paGFP se elimina rápidamente de la lisosoma (comparar ...

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Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Mientras se estudia de forma relativamente fácil el transporte de proteínas de superficie celular, visualizando el tráfico de proteínas intracelulares es mucho más difícil. Aquí, utilizamos construcciones que incorporen buenas prácticas agrarias fotoactivable y demostrar un método para seguir con precisión la proteína precursora de amiloide del aparato de Golgi compartimentos río abajo y siga su aclaramiento.

Imágenes del tráfico intracelular de APP con GFP fotoactivable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.7K vistas.  Western University.  Mientras se estudia de forma relativamente fácil el transporte de proteínas de superficie celular, visualizando el tráfico de proteínas intracelulares es mucho más difícil. Aquí, utilizamos construcciones que incorporen buenas prácticas agrarias fotoactivable y demostrar un método para seguir con precisión la proteína precursora de amiloide del aparato de Golgi compartimentos río abajo y siga su aclaramiento. 

Video: Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Etiquetado y hESCs hMSCs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante RM

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Investigación

Biología

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

La reprogramación de células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando el vector retroviral con las buenas prácticas agrarias

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Imagen funcional de grasa marrón en ratones con FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

El tomate / GFP-FLP / FRT Método para imágenes en vivo del mosaico adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.