La microscopía de láminas de luz de celosía es una poderosa tecnología de imagen, pero pocos laboratorios en el mundo son capaces de usarla. Este protocolo ofrece una descripción detallada de cómo utilizar el microscopio de lámina de luz de celosía disponible comercialmente. Es un sistema extremadamente potente capaz de imágenes tridimensionales de células individuales o embriones que permite el seguimiento en tiempo real de moléculas.
La principal ventaja de esta técnica es que puede imaginar tridimensionalmente células u órganos vivos individuales con alta resolución espaciotemporal y blanqueo fotográfico mínimo. El patrón de celosía de la lámina de luz nos permite tomar muestras de imágenes de alta velocidad y obtener vídeos en tiempo real de células y órganos vivos tridimensionales con detalles moleculares que otras técnicas no pueden lograr. Este primer protocolo de video que muestra cómo nos la microscopía de lámina de luz de celosía para crear imágenes de una sola celda de cuatro dimensiones.
Esta es una técnica muy complicada debido a la alineación y la preparación de la muestra. Y creemos que la demostración visual mejorará la accesibilidad al permitir que más científicos imaginen muchas moléculas, células y órganos diferentes en biología. Para comenzar este procedimiento, incubar cubreobjetos redondos de cinco milímetros con 0,1%poli-L-lisina a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Aspirar el líquido y dejar que los cubreobjetos se sequen al aire de forma natural. A continuación, agregue tres mililitros de gradiente de densidad a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue con cuidado las células en el borde del tubo.
Centrifugar a 930 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de esto, retire cuidadosamente la fina capa media de las células entre el medio completo y el reactivo de gradiente de densidad asegurándose de poner cada tipo de celda en un tubo cónico separado. Centrifugar a 300 g durante cinco minutos para lavar las células.
Deseche el sobrenadante y agregue cinco mililitros de RPMI a los tubos de las células T y las células CH27. Repita el lavado con RPMI fresca hasta que se hayan realizado tres lavados totales. Luego, resuspender las células en cada tubo con un mililitro de RPMI completa y contar las células con un hemocitociómetro.
Resuspender un millón de células que presentan antígenos en 500 microlitros de RPMI completa y añadir 10 MCC micromolares. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante tres horas. Después de esto, resuspender un millón de células T en 500 microlitros de RPMI completa.
Añadir dos microgramos de anti-TCR beta Alexa 488 etiquetado FAB e incubar a 37 grados Celsius con 5% dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, centrifugar ambas células a 300 veces g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Añadir 500 microlitros de RPMI completa y repetir la centrífuga para lavar las células.
Repita el lavado con RPMI fresca hasta que se hayan realizado tres lavados totales desechando el sobrenadante después de cada lavado. Después de esto, resuspendir ambos tipos de células en 500 microlitros de medios de imagen. En primer lugar, añadir 10 mililitros de agua y 30 microlitros de fluoresceína al baño LLSM.
Pulse Inicio de imagen para mover el objeto a la posición de la imagen y ver un único patrón de rayo láser Bessel. Alinee el rayo láser utilizando la guía y la región preestablecida de interés para hacer de la viga un patrón delgado que esté equilibrado en todas las direcciones. El haz también debe aparecer enfocado en la cámara del buscador.
Utilice los dos ajustadores de inclinación del espejo, el micrómetro de enfoque superior y el color objetivo para ajustar la viga. A continuación, lave el baño y los objetivos con al menos 200 mililitros de agua para eliminar por completo cualquier fluoresceína. Para crear una imagen de los cordones fluorescentes estándar, active el tramado estableciendo tres en el cuadro de rango Xgalvo y pulse En vivo para ver el campo actual.
Ajuste manualmente el espejo de inclinación, el color objetivo y el micrómetro de enfoque para obtener los valores de gris más altos. A continuación, ajuste según sea necesario para obtener patrones adecuados para los modos de exploración objetiva, Z galvo, Z plus y captura de escaneo de muestra. Después de esto, presione Ejecutar en el modo de escaneo de muestra para recopilar la función de propagación de punto de muestra para desssenganchar y desenvolucionar.
Cambie los láseres al modo de tres colores y pulse Ejecutar de nuevo. Para empezar, agregue 100.000 celdas anti-presentación al cubreobjetos circulares de cinco milímetros de diámetro preparado y démúlese durante 10 minutos. Engrase el soporte de la muestra y agregue el cubreobjetos al lado de la celda hacia arriba.
A continuación, agregue una gota de medios de imágenes a la parte posterior del cubreobjetos. Atornille el soporte de muestra en el Piezo y presione Image Home. Encuentre una celda que presente antígeno a la imagen y asegúrese de que el LLSM y el software de imágenes funcionen correctamente.
Pulse Live para ver la imagen actual. Muévete a lo largo de Z para encontrar el cubreobjetos y las células. Encuentra el centro de una celda que presenta antígenos moviéndote en la dirección Z, luego presiona Parar para pausar el láser.
Compruebe 3D e introduzca los ajustes deseados. Presione Center y, a continuación, presione Ejecutar para recopilar los datos. Baje el escenario a la posición de carga y agregue 50 microlitros de células T y medios de imagen directamente sobre el cubreobjetos.
Lo mejor es dejar que se forme una gota en el extremo de la punta de la pipeta y luego tocar la punta al líquido de baño. Vuelva a elevar la etapa haciendo clic en Retorno de imagen. Comiencen a tomar imágenes.
Asegúrese de establecer la pila Z deseada y la longitud del timelapse. Por ejemplo, la imagen 60 Z se apila con un tamaño de paso de 0,4 micrómetros y introduce 500 marcos de tiempo. Detenga la grabación antes de que se alcancen 500 fotogramas para evitar el blanqueo de fotos.
Utilice el modo en vivo para buscar pares de celdas y, cuando se hayan introducido los ajustes listos y deseados, pulse Ejecutar para recopilar datos. En este estudio, las células T primarias del ratón 5CC7 se aíslan y se preparan y luego se visualizan con un microscopio de lámina de luz de celosía. Aquí se muestran la trayectoria de viga correcta y la alineación de la viga cuando se imagen con fluoresceína.
El escaneo objetivo debe mostrar una forma X grande en las proyecciones XZ e YZ que sea lo más simétrica posible. También deben ajustarse para que sean lo más pequeños posible de una X. La exploración Z galvo debe mostrar un óvalo en XZ y XY con un solo punto a cada lado.
Por último, tanto el escaneo objetivo Z plus como el escaneo de muestra deben mostrar puntos que se vean lo más redondos posible. Usando este protocolo, se pudo ver la dinámica cuadular de los receptores de células T en una superficie de células T. La principal ventaja de este microscopio radica en la capacidad de rastrear las unidades de superficie visualizadas de los receptores de células T y obtener datos cuantificados de su tamaño, movimiento, intensidad de señal y excretas.
Lo más importante a recordar es la calidad de su alineación. La lámina de luz de celosía debe estar alineada diariamente y no hacerlo correctamente resultará en imágenes distorsionadas. Del mismo modo, la calidad del PSF recogido afecta directamente a la calidad de la desenvolución, lo que en última instancia resulta en la calidad de su imagen final.
Una de las razones por las que este método es tan poderoso es porque cada célula y etiqueta se pueden reemplazar para visualizar muchos tipos de células y moléculas. Por lo tanto, este método se puede utilizar para responder a cualquier pregunta relacionada con el seguimiento en cuatro dimensiones de moléculas. Creemos que esta técnica allanará el camino para que los investigadores exploren nuevas cuestiones dentro del campo del tráfico molecular.
Todavía no está siendo ampliamente utilizado debido al complicado sistema, por lo que esperamos que este video de Jove mejore la accesibilidad a la técnica. Los láseres utilizados en el sistema son de clase cuatro, por lo que se debe tener absoluta precaución para garantizar la seguridad del láser. Por favor, tome el entrenamiento de seguridad láser necesario antes de usar este método.
