Esta metogenética gran cantidad de hepatosferas 3D de células madre pluripotentes humanas utilizando los materiales finos y células de montaje. El principal avance de esta técnica es que permite controlar el tamaño de las esferas hepáticas 3D, limitando la formación de centros necróticos y la pérdida de fenotipo. Demostrando el procedimiento conmigo estará Yu Wang, un post-doctorado en nuestro laboratorio.
Prepárese para presentar moldes de agarosa disolviendo dos gramos de agarosa a baja temperatura de fusión en 100 mililitros de agua destilada esterilizada. Caliente cuidadosamente la mezcla en el microondas con agitación de intervalo para disolver completamente la agarosa. Añadir 520 microlitros de la agarosa derretida a un molde de formato 256 y permitir que se solidifique.
A continuación, transfiera cada microplaca de agarosa a un solo pozo de una placa de 12 pozos. Añadir 1,5 mililitros de DPBS con calcio y magnesio a cada pozo y pipetear hacia arriba y hacia abajo para eliminar las burbujas. Para preparar la suspensión celular, comience aspirando el medio a partir de un cultivo indiferenciado de células madre pluripotentes humanas, o HPSC.
Enjuague las células añadiendo cinco mililitros de DPBS a temperatura ambiente, libre de calcio o magnesio y luego retire el tampón. Añadir cinco mililitros de reactivo de disociación celular a las células e incubar a 37 grados centígrados durante seis a ocho minutos. Observe el desprendimiento celular bajo un microscopio y extienda la incubación durante uno o dos minutos adicionales si es necesario.
Detenga la reacción eliminando el reactivo de disociación celular y añadiendo cinco mililitros de MT fresco sirven un medio complementado con 10 inhibidores de roca micromolar, Y27632. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para disociar las células. Cuente las células viables con el hemocitociómetro y la tinción azul tripano para calcular el número total de células necesarias.
Transfiera el número deseado de células a un tubo de centrífuga estéril de 15 o 50 mililitros y centrífuga a 200 veces G durante cinco minutos para peletizar las células. Desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en MT servir un medio con 10 inhibidores de roca micromolar para una concentración final de 2,1 millones de células por mililitro. A continuación, salve las células añadiendo 190 microlitros de suspensión celular preparada por micro pozo de agarosa e incubando las micro placas de agarosa a 37 grados centígrados en cinco por ciento de dióxido de carbono durante dos horas.
Después de la incubación, añadir un mililitro de T-serve fresco, cálido, un medio con inhibidor de la roca a cada pocillo. Devuelva las placas a la incubadora y déjelas allí durante 24 horas. Al día siguiente, examine la esfera de la formación.
Preparar poli-dos hidroxietilo metacrilato o poli-hema recubiertos de pozos disueltos disolviendo dos gramos de poli-hema en 100 mililitros de 95% etanol y agitando la solución durante la noche en una placa caliente de 55 grados Celsius. Al día siguiente, añadir 250 microlitros de la solución a cada pozo de una placa de 24 pozos y secar la placa durante la noche en un horno de 60 grados Centígrados. Iniciar la diferenciación de hepatocitos eliminando cuidadosamente el MT servir un medio de las células previamente sembradas y reemplazándolo por un mililitro de medio de diferenciación de endoderm fresco.
Para las células madre embrionarias humanas, refresque el medio cada 24 horas durante tres días. Es importante iniciar la diferenciación de hepatocitos 24 horas después de la siembra para evitar la diferenciación celular espontánea. Después de la inducción definitiva del endodermo, cambie el medio a medio de diferenciación de hepatoblastos durante cinco días.
Reemplace el medio cada dos días, realizando el último cambio en el último día de especificación de hepatoblasto. Para transferir las hepatosferas a los pozos recubiertos de poli-hema preparado, lave las células con medio de maduración de hepatocitos y luego agregue un mililitro del medio complementado con 10 nanogramos por mililitro de HGF y 20 nanogramos por mililitro OSM. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces para levantar las hepatosferas de la micro placa de agarosa y transferirlas a un pozo recubierto de poli-hema.
Lavar la microplaca de agarosa con un mililitro del medio de maduración de hepatocitos suplementado y transferir el medio al poli-hema recubierto bien. Usando una pipeta P-100, aspira cuidadosamente el exceso de medio sin eliminar las hepatosferas hasta que quede alrededor de un mililitro de medio en el pozo. Refresque el medio cada 48 horas durante 12 días.
Si trabaja con células madre embrionarias, cambie el medio de mantenimiento de hepatocitos en el día 20 eliminando el medio de maduración, lavando las células con medio de mantenimiento y luego agregando un mililitro de medio de mantenimiento suplementado. Después de esto, actualice el medio cada 48 horas. Los cambios inmediatos deben realizarse cuidadosamente para evitar el estrés grave y la distorsión de esta estructura esférica.
La tinción de hepatocitos en marcadores mesenquimales se deleita en que las hepatosferas formadas utilizando esta técnica se componen de células hepatocitos que rodean un núcleo de células mesenquimales. Otras proteínas típicamente expresadas en hepatocitos también se encuentran en la capa externa de las esferas. El análisis funcional de las enzimas del citocromo P450 o CYP en cultivos de hepatosfera de 30 días mostró que las esferas 3D muestran niveles respetables de actividad CYP en comparación con los hepatocitos primarios humanos.
Además, se puede demostrar que las hepatosferas secretan proteínas hepáticas como la albúmina y la alfa-fetoproteína. Lo más importante a recordar para este protocolo es pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo la solución que contiene hepatosferas 3D al transferirlas a la placa recubierta de poli-hema. Esto ayuda a evitar dañarlos.
Una vez dominada, esta metodología permite la generación de esferas hepáticas 3D que permanecen funcionales durante un año in vitro con múltiples aplicaciones en el modelado de fallecidos y la detección de drogas. De cara al futuro, esta tecnología podría emplearse como una plataforma para desarrollar más tejidos entodérmicos y mesenquimales con arquitecturas complejas.
