La generación de esferoides hepáticos humanos utilizando fuentes autólogas puede contribuir a diversas áreas de investigación como toxicología, cáncer y descubrimiento de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es utilizar hepatocitos humanos derivados de BDPC para diseñar esferoides hepáticos humanos, evitando la escasez de hepatocitos humanos primarios o PHH. Los esferoides humanos autólogos pueden extenderse a la medicina regenerativa y la terapia, especialmente en pacientes con insuficiencia hepática aguda.
Anne-Katherin Schott, líder del proyecto en mi laboratorio. Comience preparando 500 mililitros de hepatoblastos KnockOut suero de reemplazo dimetilsulfóxido o KSR DMSO medio y medio de maduración de hepatocitos. Alícuota el medio de la cepa y añadir el factor de crecimiento de hepatocitos fresco o HGF y la oncostatina M u OCM a concentraciones finales de 10 o 20 nanogramos por mililitro para cada cambio de medio.
Transfiera tres veces 10 a la quinta células madre pluripotentes derivadas de la sangre o células BD-PSC a una placa de cuatro pocillos recubierta de biolaminina e incube la placa en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco días. Para apoyar la diferenciación endodérmica, cultive las células durante cinco días en medio de hepatoblastos KSR DMSO y cambie el medio cada 48 horas. En el quinto día, agregue el medio de maduración de hepatocitos y cultive las células durante siete a 10 días adicionales en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, asegurando el cambio del medio cada 48 horas.
Contar células utilizando una cámara de conteo y centrifugar BD suspensión celular desdiferenciada a 300 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de eliminar el sobrenadante, resuspender las células BD desdiferenciadas en medio KSR DMSO a dos veces 10 de las seis células por mililitro de concentración. Después de asegurar la suspensión de una sola célula, retire cualquier residuo adicional pasando las células a través de un filtro celular de 40 micrómetros.
Una vez más, cuente las células usando una cámara de conteo y prepare un volumen suficiente de cada densidad de siembra celular para dispensar el volumen requerido por pocillo. Prepare un gradiente con siembra superior de un millón de celdas a una densidad de siembra baja de 4, 000 celdas. A continuación, dispense 100 microlitros de medio KSR DMSO en placas de fijación baja de 96 pocillos y agregue 100 microlitros de dilución de siembra celular.
Incubar la placa de fijación baja durante cinco días. Cambiar el 50% del medio al tercer o cuarto día después de la siembra cuando los esferoides estén suficientemente compactos. En el quinto día, cambie el medio a medio de maduración de hepatocitos y cultive las células en él durante siete a 10 días adicionales, cambiando el medio cada 48 horas.
Después de cultivar las células durante 4, 8, 15 y 24 días utilizando el método de diferenciación descrito anteriormente, retire el medio. Incubar las células con fijadores precalentados que contengan 4% de paraformaldehído en PBS durante 10 minutos. Luego, deseche el fijador y lave las células con PBS dos veces durante cinco minutos cada una.
Agregue inmediatamente una solución de Triton X-100 al 0,1% y permeabilice las células durante cinco minutos antes de dos lavados de PBS. Agregue una solución de bloqueo hecha de PBS y albúmina sérica bovina al 5% o BSA antes de colocar las células en una placa basculante durante una hora a temperatura ambiente. Diluir anticuerpos primarios en tampón de dilución 1% BSA PBS y añadir 50 microlitros de dilución de anticuerpos por pocillo.
Deseche la solución de anticuerpos después de una incubación de una hora a temperatura ambiente y dé tres lavados de cinco minutos cada uno usando PBS. Agregue 50 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos en tampón de dilución en cada pocillo e incube las células durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las celdas tres veces con PBS durante cinco minutos cada una, monte los cubreobjetos con medios de montaje que contengan DAPI para el análisis microscópico.
Deseche cuidadosamente los medios de cultivo sin tocar los esferoides y agregue PBS recién preparado con solución Triton X-100 al 0,1% e incube durante cinco minutos para permeabilizar las células. Lave los esferoides dos veces con el medio pipeteando lentamente el medio. A continuación, incubar los esferoides con 50 microlitros de los anticuerpos primarios durante una hora.
Una vez hecho esto, retire con cuidado el exceso de solución de anticuerpos y dé tres lavados de medio. Prepare los anticuerpos secundarios correspondientes como cabra anti-ratón IgG Cy3, cabra anti-ratón IgG 488 y conejo anti-pollo IgG Texas Red en PBS con 1% BSA y agregue 50 microlitros de dilución de anticuerpos por pocillo antes de 20 minutos de incubación en la incubadora de dióxido de carbono. Nuevamente, lavar tres veces con el medio antes de 30 minutos de incubación en la incubadora.
Encienda la fuente de luz de fluorescencia 10 minutos antes de usar. Encienda la computadora y abra el software de imágenes. Utilice el objetivo de ampliación 4X haciendo clic en el botón 4X de la barra de herramientas para seleccionar la barra de escala correcta.
Luego coloque la placa de 96 pocillos en la placa central del escenario. Encienda la fuente de luz LED, use el filtro de campo claro y coloque la placa en el pozo de interés utilizando la perilla de ajuste de la etapa del eje XY. Cambie a la ruta de luz de la cámara y haga clic en el botón en vivo en el software de imágenes para visualizar la imagen en la pantalla.
Asegúrese de que el esferoide esté centrado con las perillas del eje XY y enfoque con la perilla de enfoque grueso o fino. A continuación, elija el método de observación de campo claro en la barra de herramientas, ponga la configuración de exposición en automático y haga clic en el botón de instantánea en el panel de control de la cámara para tomar una foto. Luego guarde la imagen como archivo vsi usando el nombre apropiado en la carpeta de interés.
Coloque la placa de protección contra la luz ambiental para apagar la luz LED y cambie el filtro para la excitación B. Luego elija el método de observación 488. Abra el obturador, tome una foto haciendo clic en el botón de instantánea y cierre el obturador y guarde el archivo como vsi.
Repita el proceso con un filtro para la excitación G para reiterar el proceso para cada pozo de interés. Los cambios morfológicos durante el proceso de diferenciación hepática mostraron que las BD-PSC se diferenciaron en hepatocitos a través de tres etapas. La primera etapa representó la diferenciación en células endodérmicas.
La segunda diferenciación en células progenitoras hepáticas exhibe una morfología poligonal típica. Y el tercero, la maduración a los hepatocitos. El análisis de inmunofluorescencia mostró la fuerte expresión de marcadores progenitores hepáticos humanos del endodermo como la alfafetoproteína o APF y la transtiretina o TTR en las células en la primera etapa del proceso de diferenciación hepática en L4 a L8 día.
Sin embargo, su expresión disminuyó a los 15 días. La expresión de albúmina o ALB y del factor nuclear de hepatocitos cuatro alfa o HNF4 alfa apareció primero en L4, aumentó a lo largo del tiempo de diferenciación L4 a L15, y alcanzó una expresión fuerte y estable durante el tiempo de maduración L15 a L24. Se observó agregación espontánea de células en placas de baja unión que contenían inducción de hepatocitos o formación de esferoides iniciada por medio de maduración.
Se observó una correlación consistente entre el esferoide esteroide y el número variable de células. Los esferoides formados y diferenciados en L14 y vivos teñidos con anticuerpos revelaron la potencial actividad funcional hepática de los esferoides derivados de BD-PSCs. La preparación de células mononucleares para la reprogramación es el paso más importante en este procedimiento.
La generación de esferoides hepáticos humanos es el primer paso para crear organoides in vitro versión simplificada del órgano en 3D con micro anatomía similar a la in vivo. Los organoides creados en el laboratorio se utilizan para estudiar la organogénesis, el desarrollo de enfermedades y los nutrientes.
