Aquí presentamos un protocolo quirúrgico para conejos con el objetivo de evaluar los materiales de sustitución ósea en términos de capacidades de regeneración ósea. El principio básico de este modelo calvarial de conejo es crecer nuevo tejido óseo verticalmente en la parte superior de la parte cortical del cráneo. Este modelo permite evaluar los materiales de sustitución ósea para la regeneración ósea oral y craneofacial en términos de soporte de crecimiento óseo y soporte de neovascularización.
El modelo es muy significativo para evaluar la regeneración ósea, ya que mide el crecimiento ectópico del nuevo tejido óseo por encima del hueso maduro. En comparación con los modelos tradicionales, en los que el hueso nuevo se regenera para rellenar defectos que se creó artificialmente para finalmente volver a su nivel inicial. Mediante el uso de cilindros grandes fijados en cráneos de conejo, osteoconducción, osteoinducción, osteogénesis y vasculargénesis inducida por los materiales pueden evaluarse en animales vivos o sacrificados.
Demostrando el procedimiento estará Laurin Marger, una investigadora asociada de nuestro laboratorio, y yo. Después de sedar a los animales, coloque una cánula intravenosa en la vena marginal del oído y manténgala cerrada hasta que se complete la intubación. Coloque el conejo en posición propensa y mantenga su cabeza en extensión vertical.
Anesthetizar la tráquea localmente rociando 10%lidocaína. Deslice un tubo endotraqueal de pequeño diámetro en la tráquea del conejo hasta que se pueda oír el flujo de aire en el tubo. Esto abrirá la laringe y facilitará la inserción del tubo definitivo.
A continuación, inserte una guía en el tubo para fijar la posición del tubo en la tráquea. Retire el tubo de diámetro pequeño y deslice el tubo endotraqueal definitivo en la guía. Retire la guía e infle el globo al final del tubo endotraqueal para sellar y bloquear el dispositivo en la tráquea.
Fentanilo continuamente profusa para inducir analgesia. De dos a cuatro miligramos por kilogramo de propofol para inducir la anestesia y cuatro mililitros por kilogramo por hora de acetato de timbres para mantener las condiciones isovolumétricas. Ventilar inmediatamente al animal con 3%sevoflurano en oxígeno puro.
En primer lugar, coloque el conejo en una almohadilla calentada establecida en 39 grados Celsius en la mesa de cirugía, y coloque la sonda de temperatura rectal. Afeita el cuero cabelludo. Frota la piel con 10% de yodo de provirona para desinfectar el sitio.
Luego, cubra al conejo con una cortina quirúrgica estéril y corte un área de acceso del cráneo. Desinfectar el sitio quirúrgico con 10% de yodo de provirona una segunda vez. Para empezar, anestesiar localmente con una inyección subcutánea de lidocaína en el cráneo.
Utilice el bisturí para incitar a través de la piel a lo largo de la línea sagital calvarial desde las órbitas hasta la protuberancia occipital externa, asegurándose de que el periosteum esté inciso. Utilice un elevador periosteal para elevar suavemente el periosteo a ambos lados de la incisión. Enjuague el sitio con solución salina estéril.
Primero, localice los medios y las suturas coronales en el cráneo. Tenga en cuenta que estas líneas anatómicas forman una cruz. Los cilindros se colocarán en cada uno de los cuadrantes definidos por la cruz, asegurando que el borde del cilindro no esté sobre la sutura.
Coloque el primer cilindro en el cuadrante superior izquierdo colocando el dispositivo lo más plano posible. Fije la posición del cilindro con una fuerte presión de la mano y atornille un micro tornillo hasta que se sienta la resistencia. Asegúrese de que el cabezal de tornillo esté al ras con la pestaña del cilindro.
Fije la otra pestaña del cilindro de la misma manera para fijar el cilindro firmemente en el cráneo. Asegúrese de que el cilindro esté fijado herméticamente al hueso. A continuación, repita todo este procedimiento para fijar un cilindro en cada uno de los otros tres cuadrantes.
Para comenzar, taladre un agujero intermedular bajo riego salino con una rebaba redonda en el hueso en el centro del área circunscrita por el cilindro. Asegúrese de que aparezca sangrado. A continuación, taladre dos orificios intermedulares más a lo largo del eje pasando a través de los dos tornillos de tabulación en los bordes interiores del cilindro.
A lo largo del hacha perpendicular, taladre dos orificios intermedulares más en los bordes interiores del cilindro. Repita este proceso de perforación para los otros tres cilindros. A continuación, llene el primer cilindro hasta el borde con la muestra de material.
Cierre el cilindro ajustando la tapa. Repita este proceso de llenado para los otros tres cilindros. Cierre la piel por encima de los cilindros con una sutura intermitente no reabsorbible y aplique un apósito pulverizable sobre la herida.
Después de esto, detener el suministro de analgesia y anestesia y comprobar la recuperación de la respiración autónoma. Una vez que el animal haya recuperado la respiración autónoma, detenga la ventilación. Mantener al animal bajo oxígeno puro antes de despertar completamente.
Inyectar clorhidrato de buprenophine por vía subcutánea. Repita la inyección cada seis horas durante tres días como analgesia postquirúrgica. Deje que el animal despierte completamente antes de transferirlo a su vivienda habitual con agua y alimentación completa.
El modelo descrito en este vídeo está dedicado a la evaluación de la osteoconducción, osteoinducción, osteogénesis y neovascularización en sustitutos óseos. Una vez completada la cirugía, el crecimiento óseo puede ser monitoreado en diferentes puntos de tiempo mediante el uso de tomografía ósea en animales vivos. El análisis adicional requiere que los animales sean sacrificados.
Después de la eutanasia, las muestras se seccionan y los cilindros se retiran cuidadosamente. Las biopsias se fijan con una solución de 4%formaldehído en PBS. Después de esto, la microtomografía se puede utilizar para evaluar el crecimiento óseo.
Las muestras también se pueden procesar para manchas histológicas. El análisis histomorfométrico y las tinciones específicas son posibles de completar el análisis más específicamente. Como este protocolo es un método quirúrgico, todos los pasos son críticos y deben seguirse correctamente.
Es importante ser entrenado para experimentos con animales, especialmente en el manejo de conejos y anestesia. Aparte de los métodos descritos, las células se pueden analizar más específicamente mediante el uso de citometría de flujo. La evolución del material, la maduración del tejido óseo y la mecánica también se pueden evaluar mediante el uso de nano sangría, por ejemplo.
Con la ayuda de este modelo, se realizaron muchas evaluaciones. Como por ejemplo, para jaulas de titanio o cerámica, membranas GBM, factores osteogénicos, sustituciones neonatales o el mecanismo de neovascularización durante el proceso de regeneración ósea.
