El propósito de este procedimiento es tener un modelo ex vivo para evaluar la remodelación ósea y recrear el microambiente tumoral-hueso utilizando el cultivo de la calvaria o el co-cultivo con células cancerosas. La mayoría de la técnica de la calvaria es un sistema de cultivo de órganos que utiliza huesos de calvaria de ratones neonatales para evaluar la remodelación ósea. Puede probar el potencial terapéutico de diversas moléculas, o incluso recrear el microambiente tumoral óseo cuando utilice co-cultivos con células cancerosas.
Todo ello en un ensayo sencillo y fácil en poco tiempo y bajo costo. El objetivo de esta técnica es contar con una herramienta para evaluar la regeneración ósea en el microambiente óseo canceroso, utilizando un modelo ex vivo de cultivo de órganos calvariales de ratón. Primero, selecciona un cachorro de ratón y colóquelo debajo del capó.
Usamos calvaria de cachorros de ratón de cinco a siete días de edad. Tome la cabeza con la jeringa, corte la piel y despeje el área del cuero cabelludo lo suficiente para diseccionar la calvaria. Identifique las suturas del cráneo, sagital, coronal y lambdoids.
Haga un corte recto a lo largo de las suturas lambdoide, a aproximadamente el nivel del ojo. Cortar a cada lado, de las suturas lambdoide hacia la sutura coronal. En ángulo 45, haga otro corte para conectar el extremo del corte hecho con el corte del fontanel anterior.
Es extremadamente importante definir las suturas del cráneo, sagital, frontal, coronal, lambdoid, para garantizar la correcta inclusión de tejidos y análisis histología. Con fórceps finos, retire la calvaria y colócala en una cubierta de plato de Petri. Con un bisturí, haz un corte recto desde el fontanel posterior a lo largo de la sutura sagital a través de la sutura coronal.
Se obtienen dos hemicalvarias. Recoge cada calvaria con los fórceps, y colócalos en un nuevo plato de Petri con PBS. Para el cultivo, coloque la hemicalvaria en una placa de cultivo de tejido de 24 pozos, que contenga un mililitro de medios, e incubar durante 24 horas a 37 grados.
También podemos usar cultivos calvariales primarios para reproducir el microambiente tumoral-hueso para la resorción ósea. Para ello, co-cultivamos calvarias con células cancerosas, o con medios condicionados de células cancerosas. 24 horas más tarde, retire el soporte y sustitúyalo por un medio que contenga el tratamiento que desea probar.
Si desea evaluar las células cancerosas y las interacciones óseas, o recrear el microambiente tumoral-hueso, pase la calvaria a una placa de unión celular baja, para evitar la unión de las células cancerosas a la placa. Pruebe las células cancerosas, contarlas y colocarlas cuidadosamente en la parte superior de la hemicalvaria. También puede utilizar medios condicionales de células cancerosas y utilizarlos para incubar las hemicalvarias.
Incubar durante seis a siete días a 37 grados, con cinco por ciento de CO2. Al tercer día, cambie los medios de comunicación y continúe incubando. El número de células que se usan en el co-cultivo depende de la línea celular del cáncer.
Primero necesita optimizar el número de celdas que se necesitan para inducir una respuesta en una. Después de la cultura, la calvaria pasa por un proceso de fijación, descalcificación e incrustada en parafina. Además, los tejidos se se dividen en un microtomo, se tiñen y se realiza un análisis histomorfométrico.
La inclusión de la calvaria puede ser complicada. Para asegurarse de que el tejido está protegido durante la inclusión, puede colocar el tejido entre esponjas o usar un papel tisú u otro papel absorbente antes de ponerlo en el cassette. Para el procesamiento de tejidos, envuelva la hemicalvaria en papel tisú.
A continuación, colóquelo en un cassette de incrustación, y fijar en búfer neutro en formalina, durante 24 horas a cuatro grados. Para descalcificar la calvaria, coloque el cassette en un EDTA del 10% durante 48 horas a cuatro grados. Procesar los casetes de tejido con la hemicalvaria en un procesador automático de tejidos.
Siga un ciclo de rotación de día regular, luego, incluya en la parafina. Para el corte, corte cuatro secciones microticas con un microtoma, monte las secciones en diapositivas de microscopio de vidrio y manche con hematoxilina, eosina. El análisis histológico se utilizó para realizar análisis cuantitativos de la superficie ósea y las áreas de remodelación ósea.
Las imágenes de la calvaria en los siete días fueron analizadas utilizando el software de imágenes. Para la evaluación cuantitativa, primero, defina el área para el análisis. Mira en las secciones de la telopa donde cuatro X para identificar la orientación y las suturas.
Defina la sutura coronal e identifique la superficie ósea larga en un lado, y luego la superficie corta en el otro. Bajo el aumento 40X, identifique la sutura coronal y mueva dos o tres campos ópticos lejos de la sutura, a lo largo de la superficie larga. Capture la imagen de esta área para analizarla.
Puede utilizar el software de imágenes para analizar la integridad estructural del hueso. Se puede realizar un análisis histomorfométrico cuantitativo para el espesor y el área ósea de la hemicalvaria. El análisis correcto de la calvaria depende de una buena incrustación y una orientación adecuada para obtener resultados histológicos consistentes.
Asegúrese de usar al menos tres calvarias por condición experimental. Aquí, podemos ver la estructura del hueso. En naranja, se observa el hueso.
También podemos ver la presencia del periosteo, el ostocito, el endosteo y otras partes del hueso. En nuestro caso, utilizamos insulina para aumentar la remodelación ósea. En comparación con un control, podemos ver un aumento significativo en el área ósea.
Aquí, podemos ver el efecto de la línea celular MDA-MB-231 en el modelo calvaria. Podemos ver, en comparación con el control, que la presencia de células cancerosas induce factores osteolíticos que estimulan la destrucción ósea. Usamos el modelo de calvaria para medir la regeneración ósea y las interacciones entre células cancerosas y huesos por co-cultivos con células cancerosas e histología.
También validamos nuestros datos mediante PCR cuantitativo en tiempo real. Este modelo ex vivo tiene muchas ventajas, como la organización tridimensional y la diversidad celular del hueso se conservan, y las condiciones experimentales se pueden controlar. Además, el modelo es simple, se pueden ver los resultados en un corto período de tiempo, y es de bajo costo.
Y se puede combinar con otras técnicas, como PCR cuantitativa en tiempo real, microscopía y micro-CT.
