El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método práctico para la preparación de compuestos fotocagados con propiedades adicionales como solubilidad en agua o capacidad de focalización celular. Mediante un procedimiento sintético simple, esta técnica se puede utilizar para ampliar el laboratorio sobre compuestos enjaulados y para hacer compuestos enjaulados con propiedades adicionales sin comprometer su fotosensibilidad. Esta síntesis se puede realizar en un laboratorio estándar, ya que nuestros compuestos enjaulados clickables son estables a la foto-irradiación cuando se disuelven en disolventes orgánicos no nucleófilos como diclorometano o sulfóxido de dimetil.
Demostrando el procedimiento con Hirona Sasaki se mostrarán Akinobu Suzuki, un post-doctorado, Hanami Aoki y Rei Watahiki, estudiantes de posgrado del laboratorio. Comience agregando 709,6 miligramos de metanol de paBhc y 397,6 miligramos de n-carbonyldiimidazol en un matraz de fondo redondo de 30 mililitros. Agregue seis mililitros secos de diclorometano al matraz y revuelva la solución a temperatura ambiente durante una hora.
Al final de la incubación, añadir 342,8 miligramos de 4-Dimethylaminopyridina y 552 microlitros de tert-butilo seis-amino hexyl carbamato, y agitar la solución a temperatura ambiente durante tres horas adicionales. A continuación, utilice un evaporador rotativo al vacío para eliminar el disolvente y otros materiales volátiles, y utilice la cromatografía de columna flash de gel de sílice para purificar el residuo directamente. Para instalar una unidad funcional en el compuesto de jaula que se puede hacer clic, disolver 249 miligramos de cobre dos sulfato pentahidrato en 10 mililitros de agua intercambiada por iones para dar una solución de sulfato de cobre molar 0.1.
Disolver ocho miligramos de dos paBhc ficticio paclitaxel primo, 7,5 miligramos de tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amina, 162,4 miligramos de sodio-l-ascorbato, y 3,1 miligramos de 15-cloro-3, 6, 9-trioxypentyldecyl azide en un disolvente mixto de 2,5 mililitros de 0,1 tamamp buffer de fosfato molar y 0,5 mililitros de sulfóxido de dimetil. A continuación, añadir 81,2 microlitros de 0,1 solución de sulfato de cobre molar a la mezcla de reacción y agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 80 minutos, monitoreando el progreso de la reacción con HPLC. Al final de la reacción, resuelva los precipitantes con 3,5 mililitros de una solución de agua de nitruilo de acetil al 75% y aplique la solución resultante directamente al sistema HPLC semiprecurzivo para purificar el producto deseado.
Para mediciones de eficiencia cuántica, bajo lámparas fluorescentes cubiertas con filtro de corte de luz UV, diluya la solución de material de muestra en 10 microlitros de dimetil sulfóxido con 10 mililitros de tampón KMOPS. Transfiera una alícuota de la solución al mismo tubo de ensayo utilizado en la reacción fotográfica del actinómetro químico. Irradiar la solución de muestra con 350 nanómetros de luz durante cinco segundos, eliminando 50 alícuotas de microlitros de la solución irradiada periódicamente para su análisis por HPLC.
A continuación, determine el tiempo de irradiación en segundos en el que el 90% del material de partida reaccionó mediante la adaptación de las gráficas de la desaparición dependiente del tiempo del material de partida. Para el ligando HaloTag dirigido a un compuesto enulado enjaulado, cosecha la población celular objetivo de interés con un reactivo de disociación celular adecuado y re-suspende las células en un 2,5 veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración de DMEM. Luego se siembra aproximadamente 10 a las quintas células por plato en platos de fondo de vidrio de 35 mililitros para una incubación nocturna a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
A la mañana siguiente, diluir 14 microgramos del ADN de PC de tres halo epidérmicos de ADN del receptor del factor de crecimiento en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros que contiene 700 microlitros de medio sérico reducido. A continuación, añadir cinco microlitros del reactivo de lipofección en 150 microlitros de medio sérico reducido a cada uno de los cuatro tubos y permitir que los tubos se pongan de pie a temperatura ambiente durante cinco minutos. Al final de la incubación, añadir 150 microlitros de ADN plasmático diluido a cada una de las muestras de reactivo de lipofción diluida e incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos adicionales.
Al final de la incubación, enjuague las células con dos mililitros de PBS por plato y agregue 1,5 mililitros de medio sérico reducido a cada cultivo. Añadir 150 microlitros del complejo de reactivos de lipofción plásmido a cada plato y devolver las células a la incubadora de cultivo celular durante 48 horas. Al final de la incubación, aspirar los sobrenadantes y añadir un mililitro de DMEM recién preparado complementado con dos halo fitzi fitzi de paBhc micromolar a cada plato.
Después de 30 minutos a 37 grados centígrados, aspirar el medio que contiene el compuesto enjaulado y enjuagar las células dos veces con un mililitro de PBS más para eliminar los compuestos no unidos. Añadir 500 microlitros de medio sérico reducido a cada plato y devolver las células a la incubadora de cultivo celular durante otros 30 minutos para eliminar los compuestos que entraron en las células. Al final de la incubación, enjuagar las células dos veces con un mililitro de PBS más por plato y añadir un mililitro de medio sin rojo fenol a cada cultivo.
A continuación, grabe las imágenes de florescencia mediante microscopía de florescencia confocal de escaneo láser. Para la modulación foto mediada de la localización quinasa utilizando un compuesto enjaulado clickable, la semilla aproximadamente cinco veces 10 a la quinta TOC-A-one células en dos mililitros del medio F12 de Jamón por plato inferior de vidrio de 35 mililitros. Al día siguiente, transfeque las células con la codificación plásmida para GFP diacilglicecerol quinasa gamma durante 48 horas como se acaba de demostrar.
Después del final de la transfección, sustituya el sobrenadante de transfección por dos mililitros de medio sérico reducido. Añadir 20 microlitros de solución de trabajo 100 veces paBhcAA a las células para una incubación de cinco a 60 minutos a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Al final de la incubación, coloque el plato en la etapa objetiva de un microscopio fluorescente invertido equipado con un iluminador de fluorescencia de fuente de luz dual.
Inimage las células cada 10 segundos durante 10 minutos mientras irradia las células en los puntos de tiempo experimentales y longitudes de onda adecuados de acuerdo con el protocolo experimental. Usando este método como se ha demostrado, compuestos enjaulados clicables de algunas moléculas biológicamente interesantes, incluyendo paclitaxel y ácido araquidónico, se pueden sintetizar con éxito. Propiedades adicionales como la solubilidad del agua y la capacidad de apuntamiento celular se pueden introducir en el paclitaxel simulado paBhc a través de la reacción de clic de ciclo de ciclo catalizado de cobre.
Estos paclitaxeles enjaulados enjaulados pueden ser fotolizados para producir sus compuestos principales tras la irradiación a 350 nanómetros. Las propiedades físicas y fotoquímicas de los compuestos enjaulados en las que se puede hacer clic se resumen en la tabla. En experimentos con células vivas, la focalización del halo de fitzi hexagonal paBhc a las células de mamíferos cultivadas expresa transitoriamente un receptor de proteína HaloTagged y factor de crecimiento epidérmico induce una señal de florescencia verde de la mitad de fluoresceína PAHBHC halo fitzi hexhc en la membrana celular.
Además, el tratamiento de las células CHO-K1 que expresan transitoriamente la gamma de glicerol glicerol con ácido araquidónico provoca la modulación de la localización subcelular de la gamma de diacil glicerol quinasa. También se observan cambios similares en la localización gamma de diacilo glicerol quinasa en células tratadas con paBhc-AA después de la exposición a la luz UV. Al realizar los experimentos de encado en soluciones acuosas aumentando el medio de cultivo, asegúrese de trabajar siempre bajo lámpara fluorescente con filtro tapado de longitud de onda corta.
Después de este procedimiento, puede estudiar compuestos enjaulados que han sido abundantes para su uso en experimentos biológicos debido a la falta de solubilidad del agua, permeabilidad de la membrana o capacidad de focalización celular.
